[VIP专享]传染病实习报告

实习报告一、实习目的1、通过对雏鸡接种未知的细菌和病毒，待鸡发病后进行病理剖检和细菌病毒的分离，掌握临床诊断、病理剖检和实验室试验相结合，同时掌握对一般传染病进行诊断，确定感染的细菌和病毒种类；2、掌握传染病基本临床诊断过程和实验室诊断的基本策略和方法。二、实习安排与流程（一）实习安排 时间2012年5月28日 地点逸夫楼4017 内容安排实习内容；分组；配制各种试剂和培养基；剖解雏鸡，观察脏器病理变化，并用病变脏器做组织触片；采集病变脏器；接种细菌至平板上分离培养；病料研磨匀浆，冻融。2012年5月29 日2012年5月30日2012年5月31日2012年6月1日2012年6月2日2012年6月3日逸夫楼4017逸夫楼4017江浦农场；逸夫楼4017逸夫楼4017逸夫楼4017逸夫楼4017细菌的染色镜检；细菌的纯培养；细菌的增殖培养；10%鸡红细胞制备；鸡胚接种。药敏试验；生化试验；照蛋，观察鸡胚存活情况。参观江浦农场；照蛋，观察鸡胚存活情况；观察生化试验结果；观察药敏试验结果。提取尿囊液；琼扩试验；血凝试验。 观察琼扩实验结果；观察血凝试验结果。总结实习结果，撰写实习报告（二）实习流程：纯培养药敏试验检测细菌准备实验器材，配制试剂观察动物发病情况检测病毒平板划线分离、肉汤接种生化实验病料匀浆反复冻融接种鸡胚取尿囊液鸡胚接种血凝与血凝抑制三、实习内容上周五（5月25日）：准备试验、接种病毒、照蛋等。上周日（5月27日）：接种细菌周一（5月28日）1、配制试剂：（1）生理盐水：NaCl 8.5g，加去离子水至1000ml，121℃高压15min灭菌备用。（2）PBS缓冲液：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g， 加去离子水至1000ml，121℃高压15min灭菌备用。（3）LB固体培养基和液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、琼脂 15g，加去离子水至1000ml，121℃高压15min灭菌备用。（4）氯化镁孔雀绿增菌液：取商品化粉末50g，1%琼脂粉，加去离子水1000ml，加热溶解，121℃高压15min灭菌备用。（5）亚硒酸盐胱氨酸增菌液：亚硒酸盐胱氨酸粉23g，1%琼脂粉，加去离子水1000ml，混合加热至56℃，每个试管分装3ml，水浴加热至沸腾，再煮3～5min，冷藏备用。（6）伊红美兰琼脂：取商品化粉末42g，加去离子水1000ml，按1%比例加入琼脂粉，溶解后121℃高压15min灭菌备用。待冷至50℃时，按20～25ml/块倾注无菌平板，静置至凝固，倒置备用。平板内培养基充分凝固吼，置温箱内烘干表面水分。（7）麦康凯琼脂平板：取商品化粉末53g，加去离子水1000ml，按1%比例加入琼脂粉，溶解后121℃高压15min灭菌备用。待冷至50℃时，按20～25ml/块倾注无菌平板，静置至凝固，倒置备用。平板内培养基充分凝固吼，置温箱内烘干表面水分。（8）SS琼脂：取商品化粉末62g，加去离子水1000ml，按1%比例加入琼脂粉，加热煮沸至完全溶解，冷却至50℃左右，摇匀，按20～25ml/块倾注无菌平板，静置至凝固，倒置备用。（9）琼脂：8% NaCl 24g，PBS 300ml，琼脂粉 4.03g（10）3.8%枸橼酸钠溶液：取3.8g的商品化粉末，加100ml水，溶解后121℃高压15min灭菌备用。2、雏鸡临床症状观察： 体温升高，拉稀，粪便成白色糊状，有尿酸盐沉积，羽毛粗乱，腹部羽毛被粪便污染，呆立不动，精神萎靡，眼闭不睁，喜欢打堆，呼吸较急促。3、剖检：人工发病鸡编号为1、2，进行解剖，观察各个组织脏器的肉眼病变，做好记录，同时用部分组织器官做触片经染色确定组织器官中是否有细菌存在。(1)剪断病鸡的颈静脉处死，然后在大腿与腹壁之间各剪一剪，将大腿向两侧用力压，直至股骨头露出，使其平衡仰卧放置。在腹壁划开皮肤，将其向两边掀开，注意肌肉有无出血或坏死。沿腹壁至胸侧两边向前剪断肋骨，然后用力将胸骨向头部掀开，暴露胸腹腔，观察肝、脾、心及心包、肺、肾等器官的病变。１结果：肝脏稍有肿大，其他器官无明显病变。(2)用火焰消毒过的剪刀剪下约1cm3的肝片组织在洁净的载玻片上触一下。自然干燥后革兰氏染色镜检。染色步骤：火焰固定 → 滴加草酸铵结晶紫溶液，1~2min → 水洗 → 滴加革兰氏碘液1~3min → 水洗 → 95%酒精脱色约，0.5～1min → 水洗 → 石炭酸复红（沙黄水）10~30s → 水洗 → 干燥 → 镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、细菌的分离培养：对于病变明显的脏器无菌分离细菌，划线接种伊红美蓝和麦康凯平板。用点燃的酒精棉在肝脏表面消毒，然后在酒精灯上加热手术刀片，趁热用刀片在肝脏表面划一切口，用灭菌接种环伸入切口的组织内。划线接种在麦康凯、伊红美蓝琼脂平板上，37℃培养24h后观察。5、病料处理：采集病变的脏器（脾脏、法氏囊）放入小青瓶，用剪刀粗略剪碎，加PBS缓冲液至不超过2/3小青瓶量，转移到匀浆器，匀浆，将红色匀浆液倒回小青瓶，标记，冻融3次。周二（5月29日）1、鸡胚接种：（1）制作病毒液：将昨天冻融备用的小青瓶中的混合脏器研磨液解冻，将上层透明红色液体装入EP管中，6000r/min，离心10min。取上清液，用小滤器（0.22um滤膜）过滤入灭菌的小青瓶中。 此操作严格在超净工作台完成，以免有细菌污染，导致试验失败。（2）照蛋：通过照蛋选取5个活的7-10日龄的SPF鸡胚，避开血管，画出即将打孔与相应气室处的两点位置。（3）打孔：碘酊和酒精消毒后用打孔器在酒精灯火焰烧灼消毒后，在气室处和气室下的无血管处各钻一小孔。（4）尿囊腔接种：针头从气室下的小孔处插入，深0.5cm，即已穿过了外壳膜且距胚胎有半指距离，注射量为0.1~0.2ml。（如图1）（5）封孔：点燃酒精灯融化石蜡，用小刷子沾取少量石蜡涂布在两个小孔上，注意先封气室下沿的孔再封气室处的孔，等待其凝固后，置孵育箱中直立孵育。每24h后，每天照蛋1次，如发现鸡胚死亡立即放入冰箱，于一定时间内不能致死的鸡胚亦放入冰箱冻死。死亡的鸡胚置冰箱中1-2h后即可取出收毒并检查鸡胚病变。 图1 尿囊腔接种２2、细菌的观察： 肉眼观察麦康凯和伊红美蓝平板上分离细菌的菌落形态，颜色、大小是否一致。3、细菌的染色： 在玻片上滴加一滴生理盐水，然后分别挑取可疑菌落，涂布玻片，进行革兰氏染色，观察细菌染色特征，同时与将昨天涂布且自然干燥好的组织触片染色镜检，将两个细菌进行比较，观察其是否为同一细菌。革兰氏染色方法：火焰固定 → 滴加草酸铵结晶紫溶液，1~2min → 水洗 → 滴加革兰氏碘液1~3min → 水洗 → 95%酒精脱色，约0.5～1min → 水洗 → 石炭酸复红（沙黄水）10~30s → 水洗 → 干燥 → 镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。4、细菌纯培养： 取两块SS琼脂平板，挑取经染色后初步鉴定的细菌的典型菌落接种到平板上进行纯培养。5、液体细菌增殖培养： 取装有氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、LB液体培养基的试管，一种细菌接种一套。6、10％的鸡红细胞制备 在注射器内事先加入枸盐酸钠1ml（抗凝剂与血液按1：4比例使用），抽取1只成年无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡血液4ml。将血液放入离心管内，与等体积PBS稀释液混合至离心管刻度线10ml处，于离心器内2000r/min离心5min后，弃去上层透明血浆和白细胞层，继续加PBS稀释液至10ml离心进行红细胞的洗涤。重复3次洗涤后用10倍PBS稀释液配成10%（V/V）红细胞悬液。4℃保存备用。周三（5月30日）1、照蛋观察鸡胚：死亡的淘汰，没死的继续培养。2、观察SS琼脂平板菌落的形态及颜色，并记录。3、观察LB液体培养基、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硒酸盐胱氨酸增菌液中细菌增长情况。4、药敏试验：取两块LB平板，分别用胶头吸管吸取LB液体培养基中的液体两滴，玻璃推棒均匀涂布在LB平板上。将抗菌药物圆纸片均匀贴于培养基表面，各片距离应相等。其中一块平板为：氨苄西林、哌拉西林、麦迪霉素、氨曲南、链霉素、氧氟沙星、头孢曲松；另一块平板为卡那霉素、妥布霉素、链霉素、氧氟沙星、氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶。37oC培养24h观察结果。5、细菌生化鉴定：将所有生化管中的液体都甩向一侧，然后用砂轮在生化管上端约1/3划痕，折断。然后用灭菌接种针取纯菌接种至硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、３葡磷胨水、枸橼酸盐、尿素、半固体、赖氨酸、鸟氨酸、山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖靛基质、氨对14根生化管中。倒置在小烧杯中37℃培养24~48h，观察发酵管的反应情况，并记录结果。（1）糖类（山梨醇、侧金盏花醇、木胶糖和棉子糖）分解试验：原理：接种细菌若发酵某种糖或醇，可产酸，使培养液颜色由紫色变为黄色；如发酵的同时又产生气体，培养液颜色由紫色变为黄色的同时，在微量发酵管顶部积有气泡。结果判定：接种后24h观察结果。产酸，培养液颜色由紫色变为黄色；产酸产气，培养液颜色由紫色变为黄色，并在微量发酵管顶部积有气泡。（2）靛基质试验：原理：细菌能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成红色的玫瑰吲哚。结果判定：接种后24－48h观察，阳性呈红色，阴性不变色（3）葡磷胨水（MR,甲基红）试验：原理：细菌分解培养基中葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH值至4.5以下，加入甲基红指示剂变红。结果判定：接种后24h观察结果，阳性呈红色；橙色为可疑；黄色为阴性。（4）枸橼酸盐利用试验：原理：培养基中以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，细菌若能利用这些盐作为碳源和氮源而生长，则利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的氨气反应，形成NH4OH，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色。结果判定：接种培养后48～72h观察，阳性培养基变为深蓝色，否则为阴性。（5）硫化氢试验：原理：细菌分解含硫氨基酸，产生硫化氢，与培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁发生反应，形成黑色的硫化氢或硫化亚铁。结果判定：接种后24h观察结果，培养液变黑为阳性，不变色为阴性。（6）苯丙氨酸脱氨酶试验：原理：若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。结果判定：接种后24h观察，变绿色者为阳性。（7）氨基酸脱羧酶试验：原理：若细菌能从赖氨酸或鸟氨酸脱去羧基，导致培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性，若不脱羧，培养基不变为黄色。结果判定：接种后覆盖灭菌液体石蜡，培养4d，每天观察结果，阳性者培养液先变黄后变为蓝色。（8）脲酶试验：４