桦褐孔菌原生质体制备与再生

桦褐孔菌原生质体制备与再生

孙 勇，曹小迎，陈永强，缪 倩，蒋继宏*

【摘 要】研究桦褐孔菌原生质体制备与再生条件。采用正交试验法确定复合酶比例，用单因素试验测定不同等渗液、酶解时间、桦褐孔菌菌龄、酶解温度、再生培养基对桦褐孔菌原生质体制备与再生的影响。结果表明：混合酶(纤维素酶5mg/mL、蜗牛酶15mg/mL、溶壁酶15mg/mL、崩溃酶15mg/mL)、菌龄为7d的菌丝，采用0.6mol/L MgSO4为渗透压稳定液，酶解温度35℃，酶解时间5.5h，有利于原生质体的制备。就原生质体再生而言，酶解时间为3.5h制得的原生质体，以MgSO4作为渗透压稳定液，以完全再生培养基(CYM)和麦芽酵母葡萄糖再生培养基(GYM)有利于原生质体再生，再生率最高为0.13%。

【期刊名称】食品科学 【年(卷),期】2011(032)013 【总页数】4

【关键词】桦褐孔菌；原生质体；正交试验

桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr.)Pilat)为多孔菌科(Polyporaceae)纤孔菌属((Inonotus))的药用真菌[1]，主要分布于俄罗斯北部、北欧、中国黑龙江、吉林长白山、日本北海道等北纬40～50度地区，菌核是桦褐孔菌的主要药用对象，在俄罗斯，民间广泛用于防治消化道疾病、肿瘤(胃癌、肠癌及肝癌等)、心血管疾病、糖尿病、艾滋病和O-157大肠杆菌中毒等，是一种具有开发前景的药用真菌[2-3]，因而引起科研工作者的广泛关注(包括该菌的药用成分、药理、生理生化、栽培利用等)。关于桦褐孔菌原生质体制备和再生研究，目前国内外

鲜见报道，原生质体因去掉了细胞壁的障碍而对外界刺激的敏感度显著提高，所以是诱变的良好材料，还可用于细胞融合、基因转移等方面的研究[4-11]。本实验通过对桦褐孔菌原生质体分离和再生条件的研究，使桦褐孔菌原生质体的产量和再生率均达到较高水平，为以后进行该菌菌种选育和遗传研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与酶

桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr.)Pilat)菌株分离自东北野生桦褐孔菌菌核，由徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室保存。

纤维素酶(酶活力＞15U/mg)、蜗牛酶(酶活力379U/g)上海源聚生物科技有限公司；溶壁酶(酶活力＞22500U/mg)上海如吉生物科技有限公司；崩溃酶(酶活力＞260U/mg)美国Sigma公司。 1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL，用于菌株的活化培养。PDB培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL。原生质体再生培养基：采用0.8mol/L氯化钠、0.6mol/L氯化钾、0.6mol/L硫酸镁、0.6mol/L甘露醇或0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定液，用于再生培养基和酶解液的配制或原生质体洗涤稀释等。PDA再生培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、渗透压稳定剂1000mL。麦芽酵母葡萄糖(GYM)再生培养基：麦芽糖10g、葡萄糖4g、酵母粉4g和琼脂粉20g，1000mL渗透压稳定液配制而成。完全再生培养基(CYM)：蛋白胨2g、酵母浸膏4g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸氢二钾0.48g、磷酸二氢钾0.5g、琼脂18g、再加1000mL

渗透压稳定液配制而成。 1.3 原生质体的制备与再生方法 1.3.1 菌丝体培养

桦褐孔菌菌株活化后，接种于PDB培养基中培养1 5 d，用镊子将菌丝取出，置于无菌的组织捣碎器中，加无菌水少许，将菌丝打碎，吸取1mL磨碎液接种于PDB培养基中静置培养10d，菌丝体用于原生质体制备。 1.3.2 原生质体制备与再生

用无菌接种针撩起PDB培养基中的菌膜，取出后用无菌水及渗透压稳定剂各洗两次，用无菌滤纸吸干水，置于无菌试管中，称取所需酶量，溶于0.6mo1/L渗透压稳定剂中，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后使用。按200mg湿菌丝加2mL酶液于32℃酶解，酶解完毕后用6层擦镜纸过滤去除残余菌丝片断，以3000r/min离心10min，弃上清，沉淀用渗透压稳定剂反复冲洗，离心3次，原生质体数量采用血球计数板计数。用渗透压稳定剂稀释原生质体至适宜浓度，取0.1mL的原生质体悬液涂布于再生培养基平板上，用无菌水稀释的原生质体为对照，25℃培养7～10d后观察原生质体再生情况。 1.3.3 再生率

式中：N1为渗透压稳定剂稀释长出的菌落数；N2为无菌水稀释长出的菌落数。 1.3.4 理论原生质体再生菌落数

理论原生质体再生菌落数/(个/mL)=原生质体数×再生率 1.4 正交试验设计

采用4种酶混合进行原生质体制备，以纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶和崩溃酶添加量为因素，进行L9(34)正交设计[12]；对设计的混合酶进行原生质体制备，