棉花黄萎病菌拮抗酵母菌筛选及鉴定
文雨婷1，张 媱1，李 杨1，孙燕飞1，雷勇辉2*，王 翀3
【摘 要】摘要： 为获得对棉花黄萎病菌有拮抗效果的酵母菌株，以230株酵母菌为研究对象，通过平板对峙法和琼脂块法进行筛选，并利用形态特征、生理生化特性和26S rDNA序列分析对其进行鉴定。结果表明，筛选出的6株拮抗酵母菌(ZHB39、19-10、F3、S4B2-13、T1、MLY1)随着黄萎病菌孢子浓度的降低，其抑菌活性增加，当黄萎病菌孢子浓度为104 cfu/mL时，拮抗酵母菌的抑菌圈直径最大，分别为12.50、13.83、16.33、25.17、21.83、11.17 mm，均具有较好的抑菌能力。6株拮抗酵母菌株分别被鉴定为美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、Kazachstania sp.、美极梅奇酵母、威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、Barnettozyma californica。 【期刊名称】河南农业科学 【年(卷),期】2024(047)011 【总页数】7
【关键词】 棉花； 黄萎病菌； 生物防治； 拮抗； 酵母菌； 鉴定
基金项目：国家自然科学基金项目(31860003)；石河子大学2014年高层次人才科研启动资金专项(RCZX201427)；新疆特色植物基因资源研究与利用创新团队项目(2014CC005)
棉花是我国重要的经济作物之一，在我国的农业经济中占有举足轻重的地位。新疆是我国最大的棉花产区，随着新疆棉花生产的规模化和棉花轮作模式的普及化[1]，棉花黄萎病的发生变得更加迅猛。棉花黄萎病的发病期明显提前，并
且危害显著加重，已经严重地制约新疆棉花生产的可持续发展。
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的一种土传真菌病害，病菌具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久等特点[2-3]，现阶段缺乏有效防治棉花黄萎病的手段。除了对棉花黄萎病抗性的研究，生产中多使用化学农药防治棉花黄萎病，但该方法存在严重的环境破坏问题[4-5]，生物防治可降低甚至避免这些危害。前人已筛选得到许多对棉花黄萎病菌有较好防治作用的生防菌株，主要有木霉(Trichoderma)[6]、芽孢杆菌(Bacillus)[7]、假单胞菌(Pseudomonas)[8]、链霉菌(Streptomyces)[9]、毛壳菌(Chaetomium)[10]等。一些研究证明，从植物内部、表皮及根际分离出的微生物可以在一定程度上直接或间接降低植物病原菌的危害[11-13]，而酵母菌是植物附生微生物的重要组成部分，较其他微生物而言具有遗传稳定、抑菌谱广、抗逆性强、安全性高等特点，因此常被用作病原菌的生物控制剂[14-16]。目前，利用酵母菌防治棉花黄萎病的研究鲜有报道，同时由于生防菌剂具有明显的地域性，跨地域使用往往效果欠佳。新疆地区含有丰富的酵母菌资源，因此，以新疆地区分离的酵母菌株为对象，筛选能够抑制棉花黄萎病菌生长的酵母菌，为利用酵母菌防治棉花黄萎病提供理论依据和实践基础。
1 材料和方法
1.1 材料
菌株：石河子大学生命科学学院微生物生态实验室保存的黄萎病菌VD911及从新疆地区果园、甜菜地、活性污泥等土壤中或水果表皮分离纯化获得的230株酵母菌。
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)培养基、
糖类发酵培养基、碳源同化培养基。 1.2 拮抗酵母菌的筛选
采用平板对峙法[17-18]，在PDA固体培养基中心放置直径为8 mm的黄萎病菌菌饼，将待筛酵母菌点接于距菌饼2.5 cm处，以不接种酵母菌的培养基为空白对照，观察酵母菌附近黄萎病菌菌丝生长的情况。琼脂块法参照文献[19]，挑取直径为7 mm、有抑菌活性的酵母菌菌饼，分别接种于孢子浓度为104、105、106 cfu/mL(挑取黄萎病菌菌丝于PDA液体培养基中，培养7 d，用4层纱布过滤，收集孢子滤液，计数待用)的黄萎病菌平板上，7 d后观察拮抗酵母菌的抑菌效果并测量其抑菌圈直径，每组试验重复3次。 1.3 拮抗酵母菌形态观察及生理生化特性检测
将筛选获得的酵母菌株在 YEPD 培养基平板上划线接种，28 ℃培养 2～5 d后进行菌落形态观察，记录菌落特征；将菌种接种于YEPD 液体培养基中，28 ℃振荡培养 24 h ，取样在显微镜下观察菌体形态。酵母菌的生理生化鉴定方法参照《The yeasts: A taxonomic study》[20]。 1.4 拮抗酵母菌系统发育分析
将筛选获得的酵母菌接种于20 mL YEPD 液体培养基中，28 ℃培养过夜，离心收集菌体，用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取DNA后进行26S rDNA 的PCR扩增。扩增采用酵母26S rDNA通用引物NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL-4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR体系及程序参照文献[21]并加以改进。扩增体系共25 μL：10×Taq Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，NL-1 1 μL，NL-4 1 μL，DNA 2 μL，Taq DNA聚
棉花黄萎病菌拮抗酵母菌筛选及鉴定
