“铁门”靶向抗体研究进展 - 图文

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Pharmacy Information 药物资讯, 2020, 9(3), 92-102

Published Online May 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/pi https://doi.org/10.12677/pi.2020.93014

Research Progress of “Iron Gate” Targeting Antibody

Yang Liu, Yu Liu, Yue Tong*

School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing Jiangsu

Received: Mar. 25th, 2020; accepted: Apr. 8th, 2020; published: Apr. 16th, 2020

Abstract

Iron is an indispensable micronutrient for life, and it is widely involved in many biological func-tions of life, such as cell respiration, DNA replication, cell cycle, and reactive oxygen species pro-duction. Under normal circumstances, the body’s iron homeostasis is strictly regulated. The transferrin receptor 1 (TFR1)—“iron gate”, as the main way for cells to take up iron, plays a key role in maintaining iron homeostasis. Expression of TFR1 is strictly regulated. Studies have found that the expression level of TFR1 on the luminal membrane of the blood-brain barrier (BBB) is much higher than that of peripheral capillary endothelial cells. This high expression attribute has been shown to be related to maintaining iron homeostasis in the brain. The presence of the BBB blocks the brain penetration of most drugs, and low bioavailability prevents the drug's efficacy from being exerted. TFR1, as a natural membrane receptor on the luminal membrane of the BBB, can mediate the transcytosis of the biological macromolecule transferrin. At present, the research of TFR1 antibody-based delivery of drugs into the cerebral mainly focuses on the development of the potential of TFR1 antibody to cross the blood-brain barrier and the treatment of brain diseas-es with TFR1 antibody related drugs. In addition, several studies have shown that iron overload in the body contributes to the occurrence, development, and metastasis of tumor. TFR1, as the main gate for cells to take up iron, is widely involved in this process. By targeting this “iron gate” of tu-mor cells, TFR1 antibodies have been widely used in the diagnosis and treatment of a variety of malignant tumors including hematological malignancies, pancreatic cancer and so on. This article aims to discuss the latest research progress of the TFR1 antibody targeting the cell “iron gate” in the above two aspects.

Keywords

Iron Homeostasis, Blood-Brain Barrier, Abnormal Iron Metabolism, Transferrin Receptor 1, Transferrin Receptor 1 Antibody

“铁门”靶向抗体研究进展

刘洋，刘煜，童玥*

*通讯作者。

文章引用: 刘洋, 刘煜, 童玥. “铁门”靶向抗体研究进展[J]. 药物资讯, 2020, 9(3): 92-102. DOI: 10.12677/pi.2020.93014

刘洋等

中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京

收稿日期：2020年3月25日；录用日期：2020年4月8日；发布日期：2020年4月16日

摘要

铁元素作为生命体不可或缺的微量营养素，广泛参与生命体的多种生物功能中，如细胞呼吸、DNA复制、细胞周期、活性氧产生。正常情况下，机体铁稳态受到严格调控。转铁蛋白受体1 (transferrin receptor 1, TFR1)这一“铁门”作为细胞摄取铁的主要途径，在维持机体铁稳态中起关键作用。TFR1表达受到严格调控。研究发现，血脑屏障管腔膜上TFR1表达水平远高于外周毛细血管内皮细胞，这种高表达属性已被证明与维持脑内铁稳态有关。血脑屏障的存在阻挡了绝大多数药物的脑内渗透，低生物利用度使得药物药效无法发挥。TFR1作为血脑屏障管腔膜上的天然膜受体可以介导生物大分子转铁蛋白的转胞吞。目前基于TFR1抗体的药物脑内递送研究主要围绕TFR1抗体跨血脑屏障转运的潜力开发和TFR1抗体相关药物的脑部疾病治疗展开。除此之外，多份研究表明，机体铁过载有助于肿瘤的发生、发展和转移。TFR1作为细胞摄取铁的主要途径，广泛参与这一过程。通过靶向肿瘤细胞这一“铁门”，TFR1抗体已被广泛用于血液恶性肿瘤、胰腺癌等多种恶性肿瘤的诊治中。本文旨在对靶向细胞“铁门”的TFR1抗体在以上两方面的最新研究进展予以论述。

关键词

铁稳态，血脑屏障，铁代谢异常，转铁蛋白受体1，转铁蛋白受体1抗体

This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Open Access 1. 引言

大脑作为人体相对独立的一部分，血脑屏障的存在虽然限制很多大分子物质的进入，但通过血脑屏障管腔膜上各种膜受体对营养物质的转运，大脑的稳态依旧不受影响。转铁蛋白受体1 (transferrin receptor 1, TFR1)在血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)管腔膜上表达水平明显高于外周毛细血管内皮细胞，这种高表达属性已被证明与维持脑内铁稳态有关。自从20世纪80年代TFR1抗体产生时起，围绕TFR1抗体靶向BBB管腔膜上TFR1跨血脑屏障转运研究一直在进行。近十年来，随着生物技术的迅速发展，TFR1抗体跨血脑屏障转运被直接证明。随着对TFR1抗体促发的TFR1胞内差异分选机制研究深入，TFR1抗体跨血脑屏障转胞吞的潜力将得到进一步开发，目前已有TFR1抗体相关药物走向临床试验。

正常情况下，机体各组织TFR1的表达受到严格调控，仅维持基础表达。但在很多肿瘤组织中，铁代谢被重新编程，TFR1表达显著提高。靶向TFR1抑制肿瘤细胞铁摄入已经在多种恶性肿瘤中被证明具有铁耗竭性抑制增殖、促进凋亡的作用。本文将从TFR1抗体应用的基础开始对TFR1抗体的最新研究进展做一综述。

2. 铁元素与铁稳态

微量元素是生命体不可或缺的微量营养素。铁作为人体内含量最多的微量元素，是人体内很多蛋白

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发挥活性所必须的组成成分。这些蛋白在人体中具有广泛的生物功能，包括参与细胞呼吸的细胞色素体系、铁硫蛋白；参与与氧有关的氧传感、氧转运、氧代谢的血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶；参与能量代谢三羧酸循环中的柠檬酸合酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶；参与DNA合成和修复的核糖核苷酸还原酶、脱氧核糖核酸解旋酶；参与信号转导的一氧化氮合酶、单加氧酶、氧化还原酶等[1]。人体内铁稳态受到严格调控。在全身水平上，骨形态发生蛋白–铁调素–铁转运蛋白轴对全身铁稳态进行调节，表现为当机体缺铁时，肝脏铁调素分泌下调，细胞表面铁转运蛋白运铁能力增加，一方面增加食物来源铁在小肠壁细胞向血液循环系统输入，一方面包括巨噬细胞在内的储铁细胞铁输出增加，通过增加外源和內源铁释放使得血液循环系统铁载量增加，反之亦然[2]。在细胞水平上，目前研究最透彻的是通过铁调控蛋白–铁蛋白/TFR1轴进行细胞内铁稳态调节，表现为当细胞缺铁时，铁调控蛋白表达增加使TFR1表达增加，增加铁摄取，细胞内储铁铁蛋白表达减少，减少摄入铁的储存，增加细胞代谢用铁，反之亦然[3]。

3. 铁代谢异常与肿瘤发生发展

肿瘤发生是由环境因素和遗传因素共同作用所致。归根结底，肿瘤发生与基因的改变密不可分。正常细胞的生长和增殖受到原癌基因和抑癌基因的共同调节，无论是原癌基因的激活还是抑癌基因的失活都会促发正常细胞的恶性生长，诱导细胞发生癌变。铁元素广泛参与机体生物功能中，如DNA复制、细胞呼吸、细胞周期。但同时铁也参与活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，如通过细胞呼吸产生的H2O2及O2??可以和Fe2+发生net Haber-Weiss反应产生HO?自由基。铁元素同样可以介导脂质ROS的产生。ROS可以诱导DNA碱基修饰和DNA链的断裂。目前认为，过多ROS产生与肿瘤发生密不可分。一份来自于铁与癌症间关系的流行病学数据显示，相比低血液转铁蛋白载铁饱和度，高血液转铁蛋白载铁饱和度致癌风险更高[4]。遗传性血色沉着病作为典型的铁过载型疾病，研究表明血色沉着病患者多种癌症发生风险增高，其中肝癌发生率是正常人的20~200倍。Shinya Akatsuka等人通过对过量铁诱发的肾细胞癌基因组进行分析，结果显示广泛的基因组改变，表明由铁介导的ROS过量产生是基因组改变的原因[5]。流行病学数据结合肿瘤基因组分析结果都表明铁过载有利于肿瘤发生。铁过载同样可以促进肿瘤的生长，这种促进作用可以通过减少膳食铁摄入、使用铁螯合剂和调控铁代谢相关蛋白如阻碍TFR1介导的铁摄入、促进铁转运蛋白介导的铁输出，失活铁调控蛋白等逆转。铁过载也显示出促进肿瘤转移的作用，Jiabei Wang等人使用铁螯合剂提高了细胞内抑癌基因NDRG2 (N-Myc downstream regulated gene 2)表达水平，从而抑制了肝细胞癌上皮间质转化[6]。Wenli Guo等人同样发现铁转运蛋白的过表达阻碍了小鼠的乳腺癌生长以及向肺和肝的转移[7]。由此可见，铁元素对于肿瘤的发生、发展和转移都是必不可少的，肿瘤细胞对铁的依赖性甚至可以是上瘾的。针对肿瘤细胞这一特性，靶向铁代谢途径已经被广泛用于疾病诊断、药物研发及预后评估。

4. TFR1和TFR1抗体

TFR1，亦称作CD71，为一种单程二型跨膜糖蛋白分子，相对分子量约为84 KDa。TFR1在细胞膜上主要以同源二聚体的形式存在，在结构上主要分为氮端胞内区(1-67AA)、跨膜区(68-88AA)和胞外域(89-760AA)。胞内区含有内吞基序(YXRF)，参与内吞。胞外茎区(89-120A)通过两个二硫键将TFR1连成同源二聚体。胞外蛋白酶样结构域(121-188AA, 384-606AA)、螺旋结构域(607-760AA)参与结合载铁转铁蛋白(holo-transferrin, holo-Tf) [8]。TFR1作为细胞摄取铁的主要途径，可与血液中的holo-Tf结合。holo-Tf-TFR1复合物以网格蛋白介导的内吞向细胞内输送铁元素，进而维持细胞内的铁稳态。正常情况下，TFR1本身受到严格调控，在机体的许多组织中仅有基础表达。目前仅发现在脑毛细血管内皮细胞、

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肝细胞和快速增殖的细胞上表达增加。除此之外，很多恶性肿瘤细胞表面TFR1表达明显增加。

依据识别的TFR1部位，TFR1抗体主要分为两大类，一种为靶向TFR1配体结合部位，可以对holo-Tf与TFR1的结合产生竞争性抑制作用。另一种为靶向非配体结合部位，这种非竞争性结合并不会明显阻碍holo-Tf与TFR1的结合。配体竞争性TFR1抗体具有阻碍TFR1向细胞内输送铁的能力，主要应用于抗肿瘤研究。研究表明，配体竞争性TFR1抗体可使高表达TFR1的肿瘤细胞铁耗竭性死亡[9]。非配体竞争性TFR1抗体不会影响TFR1正常的运铁功能，对细胞毒性较小，主要应用于跨血脑屏障脑内转运研究。

5. TFR1抗体在跨血脑屏障药物脑内递送方面的研究进展

5.1. TFR1抗体跨血脑屏障脑内转运潜力开发

早期的研究表明，TFR1在啮齿类动物和灵长类动物的脑毛细血管内皮细胞上有功能性表达，且表达量显著高于外周毛细血管内皮细胞。这种高表达属性在脑毛细血管内皮细胞离体培养初始就会丢失，结合脑内TFR1广泛存在这一事实，说明脑毛细血管内皮细胞上TFR1表达增加在维持脑内铁稳态方面具有重要作用[10] [11] [12] [13]。早期的同位素示踪实验已经证明，无论是铁元素还是转铁蛋白(transferrin, Tf)都可以被高度选择性内吞入脑毛细血管内皮细胞，只不过两者在细胞内的命运不同。铁元素在细胞内被富集随后很快分散于脑实质中，有关铁元素由内皮细胞进入脑实质的机制目前依旧处于研究中。Tf在内皮细胞中的饱和度远远小于铁元素，这种现象与受体介导的转包吞相符，不过Tf-TFR1复合物在脑毛细血管内皮细胞内转包吞确切路径目前依旧不是很清楚[12] [14] [15] [16]。从21世纪开始，研究者对TFR1抗体跨血脑屏障脑内转运能力进行了广泛的研究，如早期设计靶向TFR1非配体结合部位的TFR1抗体(8D3, OX26)。8D3为一种大鼠来源针对小鼠TFR1的非配体竞争性抗体。OX26为一种小鼠来源针对大鼠TFR1的非配体竞争性抗体。非配体竞争性旨在不影响受体功能和BBB完整性的同时，希望通过TFR1介导的转包吞作用实现TFR1抗体脑内渗透。虽然Pardridge WM [17]等人将8D3作为药物转运载体明显增强了中风[18]、阿尔兹海默症[19]、帕金森病[20]、黏多糖贮积症[21]等中枢神经系统疾病治疗药物小鼠脑内药效，但这些实验中缺乏直接证据表明TFR1抗体脑实质的广泛存在。这些实验缺少恰当的同型对照，同时不可忽略的抗8D3抗体在长期给药过程中的存在是否会对BBB完整性产生破坏进而影响实验结果这一点也没有得到验证。后期Gemma Manich等人的实验验证了8D3脑毛细血管内皮细胞的靶向性，但同时确认8D3无法有效实现向远腔侧转移，并且随着时间的推移8D3趋向于胞内降解。同样地，OX26也被证明更趋向于胞内降解[22] [23]。

近十年来，研究者针对8D3、OX26等高亲和力抗体较低水平的脑内渗透原因提出了多种假设，并对这些假设进行了实验验证。Jens Niewoehner等人提出抗体价态可能在TFR1抗体跨血脑屏障转运中起到重要作用。天然配体的单价结合转包吞模式可能会被抗体双价结合模式打破，造成TFR1间的广泛交联，最终导致抗体滞留在细胞内走向溶酶体降解途径。这种假设在针对TFR1的单价抗体结合模式中得到了验证，实验中TFR1单价抗体更倾向于向远腔侧转运，具有更广泛的脑内暴露。单价抗体内吞后与溶酶体标志物共定位情况符合天然配体正常溶酶体降解命运，成功使运载的药物脑内暴露量增加了一个数量级，而正常双价抗体仅仅被发现定位于脑毛细血管内皮细胞内，与溶酶体共定位率超过了50%。这些结果表明TFR1抗体价态影响TFR1细胞内分选及命运[24]。Y. Joy Yu等人提出了另一种假设，认为抗体的亲和力可能影响TFR1胞内转运，最终影响TFR1和抗体细胞内命运。作者通过对TFR1双价抗体和TFR1单价抗体进行亲和力改造，证明了无论是单价还是双价高亲和力抗体相比低亲和力单/双价抗体趋向于引起更多的TFR1内吞后降解。增加的TFR1降解显著减少TFR1的循环和BBB管腔膜上TFR1密度，这些可能最终导致高亲和力TFR1抗体脑内暴露减少。相比而言，低亲和力TFR1抗体更多地保持了TFR1

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正常胞内转运路径，显著增加TFR1抗体脑内暴露[25] [26] [27]。除了TFR1抗体亲和力和价态对TFR1内化后分选途径产生影响外，抗体的pH敏感性也被认为对TFR1内化后命运产生影响。Hadassah Sade等人通过比较两个亲和力相当的TFR1抗体内吞入脑毛细血管内皮细胞后命运发现，在低pH下亲和力降低的抗体可以实现有效的转包吞，如同天然配体的转包吞一样，而pH不敏感的抗体则明显滞留在内皮细胞中最终被降解。这种pH敏感型抗体转包吞可以被内体酸化抑制剂所抑制。这些结果表明抗体在进入内体后因pH敏感性使之在内体酸性增加的条件下更趋向与TFR1解离，这有助于抗体摆脱降解命运，胞吐出细胞[28]。除此之外，TFR1抗体识别的表位也可能会对TFR1内吞及胞内分选途径产生影响，因为从目前已知的Tf-TFR1复合物转包吞机制来看，无论是Tf与TFR1的结合，还是Tf-TFR1复合物内吞后内体酸化，TFR1本身一直经历蛋白空间结构的变化，而这种结构变化可能正是促发相应内吞及内体分选的关键信号，TFR1抗体与TFR1间的相互作用可能影响TFR1这一过程中正常的结构变化。相信随着对受体介导的转包吞机制研究深入，TFR1抗体跨血脑屏障转运潜力将会得到更大的开发。

5.2. 在脑部疾病治疗中的应用

血脑屏障阻挡外源病原体进入大脑的同时也阻挡了几乎所有生物大分子和超过98%小分子物质进入脑内。针对脑部疾病，虽然有很多候选药已经进入临床，如用于治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) [29]、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF) [30]；用于治疗脑卒中的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) [31]、促红细胞生成素(erythropoietin, EPO) [32]；用于治疗帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的胶质细胞源神经营养因子(glialcellline-derived neurotrophic factor, GDNF) [33]；用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)的bapineuzumab [34]等。但由于缺少足够的脑内渗透，导致这些药物的临床治疗效果都不是很理想。药物要想发挥作用需要与靶标直接接触并且达到药效浓度。Yu YJ团队在之前的工作中已经验证了降低亲和力的TFR1抗体脑内生物利用度的显著提高。β分泌酶(BACE1)作为一种天冬氨酰蛋白酶，其有助于β淀粉样肽形成，是阿尔兹海默症治疗有效的靶点之一。研究表明，靶向TFR1和BACE1的双特性抗体(anti-TFR1/BACE1)无论是在hTFR1转基因小鼠还是在食蟹猴中都显示出高于亲本BACE1抗体的脑渗透和抑制β淀粉样肽产生的能力。同时该抗体并未对食蟹猴造血系统和全身铁稳态产生较大影响[35]。黏多糖贮积症II (MPSII)为一种X染色体隐性遗传病，主要起于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)基因突变所致的IDS酶活丧失，引起包括硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS)在内的糖胺聚糖(GAGs)全身累积。目前该病的主要治疗方法为酶替代疗法，但传统的酶替代疗法无法实现脑内治疗。Hiroyuki Sonoda等研究人员将hIDS与hTFR1抗体融合，融合蛋白JR-141在3 mg/kg静脉注射剂量下，不仅使MPS II模型小鼠外周组织GAGs水平恢复正常，而且克服了传统酶替代疗法无法实现脑内治疗的局限，使大脑中GAGs水平降低到接近正常水平，MPSII相关中枢神经系统症状得到明显缓解[36]。已完成的JR-141治疗MPS II的I/II期临床试验结果显示，以每周2 mg/kg剂量静脉给予JR-141，持续四周，安全且耐受性良好。四周疗程后患者脑内硫酸乙酰肝素(HS)相对治疗初始减少了约31.5% ± 3.9%，部分患者表现出运动和行为的改善[37]。

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人中最具侵袭性和致死性的脑肿瘤。外科手术切除和放化疗联合治疗依旧是目前最经典的方法，但GBM患者预后仍然较差。不良预后除了跟GBM自身的高侵袭性和浸润性有关外，还跟药物抗性密不可分。GBM对标准化学治疗剂替莫唑胺(Temozolomide, TMZ)的抗性目前认为主要是跟GBM细胞O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)的过表达有关。因为该酶可以通过去除鸟嘌呤O6位上的简单烷基来修复TMZ诱导的DNA损伤。许多研究已经表明，增加p53抑癌基因表达可以下调DNA修复基因(如MGMT)的表达，增加肿瘤细胞对烷化剂的

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