本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名 孙 永 升 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 酶 工 程 < 实 验 > 教师及职称 李 俊 俊 < 讲 师 >
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期 填报时间 2013 年 4 月 24 日
云南师范大学教务处编印
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实验名称 实验方式 小组成员 XX 实验三 纤维素酶最适反应pH值的测定 小组合作 XX XX XX 1、 实验目的 掌握酶最适pH值的测定方法及原理。 2、 实验仪器、试剂和溶液： A 2 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。 B 2 试剂和溶液 ① DNS试剂(CMCA-DNS )：称取 3,5 一二硝基水杨酸(10士0.1) g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。 ② 乙酸-乙酸钠缓冲液，0.01mol/L ③ CMC-Na溶液（底物溶液） ④ 纤维素酶液(pH4 .8 和pH6 .0)。 3、实验原理及实验流程或装置示意图： A 3原理: pH值对酶反应速度有显著影响。每一种酶都有一个特定的最适反应pH值，在
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此pH值下酶反应速度最快，而在此pH值两侧酶反应速度都会受到影响而放缓。因为酶蛋白是两性电解质，具有许多可解离基团，在不同的酸碱环境中这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，而他们的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用。表现酶最大活性的pH值即为该酶的最适pH值。不同的酶其最适pH值不同。 pH与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的最适情况下，选用一系列变化的pH环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。 B 3 实验流程: 酶液的稀释（不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释） ↓ 不同pH下（55℃）水浴30min ↓ 沸水浴10min ↓ 迅速冷却至室温,用水定容至25ml ↓ 540nm处测吸光度（OD540） ↓ 绘制pH -酶活力曲线求出纤维素酶最适pH 4、实验方法步骤、操作流程及注意事项： A 4 、实验方法 1、本实验在pH值3.0至10.0之间选择不同pH值环境下测定酶活力，以找出 纤维素酶在此条件下的最适pH值。
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2、 待测酶液制备 称取固体纤维素酶1g，精确至0.1mg，用蒸馏水溶解，用不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲液准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差落在0.2—0.5范围内，不在此范围内，酶液要进行重新稀释），待测。 本实验在室温下55℃下选择不同的pH值来测定酶活力，以找出在此条件下的最适pH值。 编号 1 2 3 4 5 5.0 6 5.5 7 6.0 8 9 10 7.5 11 8.0 12 8.5 13 9.0 14 9.5 15 10.0 pH 3.0 3.5 4.0 4.5 6.5 7.0 表一 B 4、操作步骤: （1）取3支25mL刻度具塞试管（1支做空白管，2支做样品管）。 （2）分别向3支管中准确加入不同pH值的CMC-Na溶液2.00mL 注意：加入CMC-Na溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。 （3）分别准确加入稀释好的待测酶液0.5mL于2支样品管中（空白管不加） 用涡旋混合器混匀。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺 着试管壁加入） （4）将3支试管同时置于酶反应最适温度水浴中，准确计时，反应30min， 取出。 （5）迅速准确地向3支管中加入3mLDNA试剂（加液顺序和加酶液顺序相同以保证反应时间相同），振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL，摇匀。将3支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸10min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。 （6）以空白管调零，在分光光度计540nm波长下，用1cm比色皿，分别测量2支样品管中样液的吸光度OD值，分别记为ODE1、ODE2 ，取二者平均值。带入标准曲线方程计算酶活力。 D 4 实验注意事项 4
① 反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释 ②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； ③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。 ④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； ⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时； 5 实验处理 A 5葡萄糖标准曲线如 图1： 葡萄糖标准曲线0.70.6y = 0.7023x - 0.0747R2 = 0.9992OD540nm值0.50.40.30.20.1000.20.40.60.811.2系列1线性 (系列1)葡萄糖浓度(mg/ml) 图1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023，R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度, 0.0747表示补偿参数。 B 5 纤维素酶酶活力（U/g）=(K×平均OD+b)×N/(0.5×0.5)式中：
K——标准曲线的斜率;b——标准曲线的截距; N——试样的总稀释倍数;0.5——反应酶液的体积，mL;0.5——反应时间，h。 酶活力的计算值保留3位有效数字 注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在±8%以内，二者的平均值为最终的酶活力测定值。
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酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)
