2016下游处理技术课程综述
学校代码：__11059__学 号：1302021035
Hefei University
下游处理技术
XIAYOUCHULIJISHUZONGSHU
论文题目： 学位类别： 学科专业： 作者姓名： 导师姓名： 完成时间：
等电点沉淀法在蛋白质分离的应用
本科 生物技术 刘壮 于宙 2016.4.23
2016下游处理技术课程综述
等电点沉淀法在蛋白质分离的应用
摘要
发酵相对工业合成一些产物来说可以降低生产成本或者制造出工业合成无法合成的产品。发酵液的预处理是为了改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）；能够除去部分杂质[1]。发酵液的杂质很多，而且十分复杂，其中就包括杂蛋白，在发酵生产过程中杂蛋白质的去除主要包括：等电点法去除蛋白质法，离子结合去除蛋白质法，加热变性去除蛋白质法，大幅改变pH值去除杂蛋白法，有机溶剂或表面活性剂去除杂蛋白法等。等电点法去除蛋白质虽然有其独特的优势，虽然在工业生产中等电点法不可能将蛋白质完全去除，常和其他一些蛋白质去除的方法一起使用。但本文重点讨论等电点沉淀法在蛋白质分离的应用。
关键词：等电点；优势；原理；pH
沿革
等电点的定义是：使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的静电荷为零）的pH值[2]。等电点法在发酵生产中十分普遍。利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀。等电点法沉淀适用于疏水性较大的蛋白质（如酪氨酸）。亲水性很强的蛋白质（如明胶）在水溶液中溶解度较大，在等电点的PH值下不容易产生沉淀[3]。因此，等电点沉淀法没有盐析沉淀法使用的广泛。但是相对盐析沉淀来说，等电点法的优点在于不需要除去后续的脱盐操作。等电点法还有另一个缺点就是PH值过低，就很容易引起目的蛋白质的变性。等电点法在去除蛋白质长和盐析法、有机溶剂法和其他的沉淀方法一起使用，以提高沉淀的效果，因为单靠调节pH值至等电点的方法并不能将大多数蛋白质除去。等电点法需要调节pH值，而加入的一般是无机酸，无机酸的成本相对较低，在工业生产中具有一定优势。
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原理
蛋白质是带有正电荷和负电荷的两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量则因pH不同而变化。蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于蛋白质分子没有静电斥力而趋于沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点以上或者以下的pH值时，蛋白质分子携带同种符号的静电荷而相互排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把混合物分开。当pH被调制蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或者全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质仍存留在溶液中。这样等电点处理还有一个好处，就是这样沉淀的蛋白质依然具有天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中，便于工业生产中杂蛋白的回收利用。
[4]
pH对发酵的影响
微生物在其生长和生物合成都有最合适的pH值或者最适范围。合适的pH值可以最大
限度地获得产量。过酸或者过碱会影响菌种的代谢，在发酵过程中引起pH值改变的根本原因是由于微生物代谢营养物质的结果。所以在预处理的时候要考虑以上因素。
注意事项
等电点沉淀的操作条件是：低离子浓度；pH≈pI。因此，等电点的操作需要在低离子强度下调节pH值至等电点，或在等电点的pH值下利用透析等方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。由于一般蛋白质的等电点多在偏酸性范围内，故在等电点操作中，多通过加无机酸（如盐酸、磷酸和硫酸等）调节pH值[5]。而无机酸的成本比较低。在盐析中也经常用到等电点沉淀的原理，使盐析操作在等电点附近，降低蛋白质的溶解度。但是，利用中性盐盐析时，使蛋白质溶解度最低的溶液pH一般要比蛋白质的等电点偏小。工业生产中应注意在加入无机酸调节pH值时，避免局部的pH过低，导致产物遭到破坏。
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工业生产应用
在谷氨酸的发酵生产过程中，从发酵液提取粗制的谷氨酸常用的方法用盐酸和硫酸调
一次冷冻等电点带菌提取工艺。其成功的机率和收得率的高低，直接取决于发酵液的优劣。但是在实际工业生产中由于菌种，原料，设备或者操作的原因，常会存在一些隐患，容易使发酵液出现异常，导致不容易用等电点法提取优质的发酵液。其原因是异常发酵液含不利于等电点提取的有害物质较多。如生物蛋白(包括植物性和动物性)、胶体物质含量较高、粘性增强、泡沫大，酮酸高、甚至呈现异臭，外观色泽呈现红褐色，严重的尚有絮状不溶性悬浮物的存在。在考虑生物蛋白对提取的影响时，一定要注意 ，不同种类的蛋白质，具有不同的等电点，在中和过程中，时刻要关注蛋白质絮状物的变化;且其pH值定要控制在一定范围内，否则，会使其他一些物质遭到破坏造成严重的经济损失。同时这也提醒我们在工业生产中要注意发酵液的变化和酸的加入要注意均匀，不可使局部pH过低！
[6]
总结
蛋白质等电点法去除蛋白质在工业生产中经常能用的到。在工业生产中等电点法在去除蛋白质长和盐析法、有机溶剂法和其他的沉淀方法一起使用，以提高沉淀的效果，因为单靠调节pH值至等电点的方法并不能将大多数蛋白质除去，等电点法在发酵生产中要调节一定的pH值，可是这可能会引起其他物质的变性。但等电点法去除的蛋白质会保持着天然的构象，这样会方便沉淀下来的蛋白质的回收利用。
参考文献
[1]曹军卫，马辉文，张甲耀. 微生物工程[M]. 北京：科学出版社，2007.192. [2]龚祝南. 生物化学精要[M]. 南京：东南大学出版社，2009.1. [3]孙彦. 生物分离工程[M]. 北京：化学工业出版社，2013.33-34.
[4]王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学上册[M]. 北京：高等教育出版社，2002.305. [5]孙彦. 生物分离工程[M]. 北京：化学工业出版社，2013.33.
[6]张立德. 异常发酵液等电点提取的探讨[J].发酵科技通讯，2002.31（2）：21-25.
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