微生物实验
微生物实验
细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察
一、实验目的
1. 2. 3. 4. 5.
掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 掌握细菌的三种形态
掌握临床常见细菌的形态及染色 掌握细菌的特殊结构
了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点
二、实验原理
1. 普通光学显微镜（油镜）的使用
1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头
2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护
1. 移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前
2. 油镜用毕后， 要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最
后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头
3. 镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4. 做好使用记录 3． 微生物知识
1． 细菌按形态分类：
球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2． 细菌的基本结构
细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3． 细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌
鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛
芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌
4． 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。
原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5． 真菌
单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
多细胞：菌丝及孢子、孢子出芽。如：霉菌 6． 白假私酵母菌（白念）
生物学性状：G+单细胞真菌、芽生孢子、类酵母型菌落
厚膜孢子、假菌丝有助于鉴定
致病性：皮肤粘膜——鹅口疮、 内脏感染、CNS感染
微生物学检查：直接涂片、染色后镜检——菌体、芽生孢子、假菌丝 7． 新型隐球菌
生物学性状 ：圆形酵母型菌、外周有厚荚膜（比菌体大1-3倍）
致病性：吸入后侵犯皮肤、粘膜等——慢性炎症和脓肿；侵袭CNS——亚急性或慢
性脑膜炎
微生物学检查：脑脊液离心后取沉淀、痰和脓标本直接检查；墨汁负染见出芽菌体
外围有宽厚荚膜为阳性
三、实验材料
记号笔：1支；大镊子：1支；火柴： 1盒；蜡笔：1支；试管架： 1个；酒精灯：1个；接种环： 1支；Olympus显微镜：1台；显微镜使用记录本：1个
四、实验内容
1. 观察细菌三种形态 1）球菌
链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌（子弹形）、脑膜炎双球菌（蚕豆形）、四联菌 2）杆菌
破伤风杆菌、白喉杆菌（异染颗粒）、绿脓杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌 3）螺形菌
弧菌——霍乱弧菌；螺菌；螺杆菌——幽门螺杆菌；弯曲菌 2. 观察细菌的特殊结构
芽胞、鞭毛、荚膜、异染颗粒、钩端螺旋体、幽门螺杆菌 3. 绘图
葡萄球菌(staphyloccocus)；肺炎双球菌(pneumo coccus)；脑膜炎球菌(meningococcus)；破伤风杆菌（Clostridium Tantenus）；霍乱弧菌（vibrio cholera)；芽胞(spore)；鞭毛（flagellum)；荚膜(capsule)；钩端螺旋体(leptospira)
五、实验结果
绘8幅细菌镜下图，已交。
六、思考与讨论
1． 显微镜高倍镜使用时看不清楚的常见原因
（1） 未滴加镜油 （2） 镜头不干净
（3） 标本放置反了，所以达不到对焦平面 （4） 制片问题：标本太厚、染色误差等
细菌分布
一、实验目的
1. 掌握固体培养基的制备
2. 掌握机体常见部位及环境中的细菌采样、培养、及初步鉴定 3. 掌握革兰氏染色方法及结果判定
二、实验原理
1. 培养基：
1． 细菌生长所需营养物质：水、碳源、氮源、无机物和生长因子 2． 培养基分类：
（1）根据营养物质：营养培养基、选择培养基、鉴别培养基 （2）根据物理性质：液体培养基、固体培养基和半固体培养基
3． 细菌在培养基中的生长状况：表面生长、均匀浑浊生长、沉淀生长 2. 革兰氏染色：
革兰阳性细菌细胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，通道弯曲，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后孔径仍可使结晶紫与碘的复合物通过，因而将染料洗去而被脱色。
三、实验材料
咽拭子、羊血培养皿：1套/人；大号普通培养皿：1块/2人；载玻片：1片/人； A、B菌：6套/桌；NS：1份/人；滤纸：1张/人；消毒液：4套/桌；三角瓶、电天平、营养琼脂、称药纸、称药勺、量筒：1套/桌
四、实验内容
1. 培养基制备
1）按产品要求称取营养琼脂 2）每实验桌制备200ml
3）高压蒸汽灭菌后，在洁净工作台内倒平皿 4）所制备的普通平皿用于空气培养 2. 机体不同部位的细菌采样、培养 1）咽部正常菌群的采样、培养
咽拭子擦拭咽部，平行划线法接种于羊血平皿。 2）手指消毒前后细菌的采样培养
未消毒手指平行划线法接种于普通平皿；同一手指碘酒、酒精消毒后平行划线法接种于普通平皿。
3. 环境中细菌采样培养 1）空气培养
将培养皿打开暴露于空气中，20分钟后盖好平皿盖儿 2）流通纸币（或硬币）的细菌采样培养
将硬币正反面分别在培养基上充分接触
3）采样结束后，将培养皿底部朝上放入铁丝筐，统一置培养箱：37℃ 18-24小时 4. A、B、C菌鉴定（革兰氏染色法） 1）. 细菌涂片制备程序：
（1）取一干净玻片，火焰上方缓缓通过三次去油 （2）蜡笔画线将玻片分割为A、B、C三区域
（3）接种环取生理盐水分别滴入A、B两区域各一滴
（4）分别取少许A、B 、C菌 ，与生理盐水充分混匀成菌液，风干后形成菌膜 （5）固定（火焰上方缓缓通过三次） （6）革兰氏染色
（7）滤纸吸干水分，油镜观察 2）. 革兰氏染色：
（1）细菌涂片、火焰固定 （2）结晶紫初染 1min （3）卢戈氏碘液媒染 1min （4）95%乙醇脱色 30-40s （5）沙黄复染 1min
五、实验结果
A：G+，球菌，推测为金黄色葡萄球菌； B：G-，短杆菌，推测为大肠杆菌；
六、思考与讨论
1． 影响革兰氏染色的因素： （1）细菌本身因素：
菌龄：如果菌龄太大，可能出现假阴性 （2）操作因素
涂片：取菌应适量，涂片要均匀，如果某个部分菌层太厚，可能在脱色时达不到，会导致局部假阳性 固定：固定温度太高或时间太长都会导致细菌结构破坏而出现假阴性；但是固定不够，细菌会在水洗时被冲掉
初染：初染时间虽然说是1分钟，但是可以适当延长，时间太短会出现假阴性；染色滴加不均匀可能出现半阴半阳 媒染：和初染一样
脱色：脱色时间不能过长，基本上用酒精滴过之后马上水冲就可以了，否则容易出现假阴性
复染：复染时间需足够长，否则可能会染不上
微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)
