第三章 蛋白质的共价结构
一、蛋白质通论 （一）、蛋白质的化学组成 碳 50%
氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0-3%
其它微量元素（包括磷，金属元素等，这些是蛋白质的辅助成份或修饰成份） 在这些化学元素中，氮的含量在不同蛋白质中很稳定，所以可以根据氮元素的含量测定蛋白质的含量：
蛋白质含量＝蛋白质氮 × 6.25
这是蛋白质定量分析的理论基础，经典的蛋白质含量测定方法就是先测定蛋白质氮的含量，再根据上述公式计算蛋白质的含量。 （二）、蛋白质的分类
（三）、蛋白质的形状和大小
蛋白质的大小与分子量
蛋白质的分子量变化较大，从6000到1,000,000道尔顿（dolton）。蛋白质的分子量可以通过实验予以测定，通常也可根据氨基酸的数目估计： 蛋白质的分子量（dolton）＝氨基酸残基数×110 但对于结合蛋白上述公式不适应。 蛋白质的结构层次
一级结构： 氨基酸序列 二级结构： α螺旋，β折叠 三级结构： 所有原子空间位置 四级结构： 蛋白质多聚体
1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。
介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。 (五）蛋白质的功能
1.酶2.结构成分3.氨基酸的贮藏 4.运输功能 5.运动 6.激素 7.免疫 8.信息传递 9.基因表达调控 二、肽
由氨基酸聚合而成的线性结构叫肽链（peptide chain)，蛋白质就是由一条或多条肽链组成。蛋白质的共价结构也即是肽链的结构。 蛋白质的共价结构有时也称一级结构。但根据IUPAC的规定蛋白质的一级结构指肽链的氨基酸顺序。 （一）、肽和肽键的结构
1.蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的多肽链分子，肽键是它的连接方式。蛋白质一级结构中的另一种共价结构是二硫键。它使同一条链内或两条链间的两个巯基形成二硫键。 2.肽键的结构
3.有关肽的名称 多肽，环肽，阅读方向，氨基酸残基 4.肽键的性质 刚性，反式
肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连
残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。 （二）肽的物理与化学性质 1.带电性 短肽：酸碱性由末端的α—氨基和α—羧基和R基团的可解离基团决定，滴定曲线相似于氨基酸的滴定曲线。其中α—氨基的pK值较游离氨基酸小，α—羧基的pK值较游离羧基大，R-基团变化不大。
长肽或蛋白质中酸碱性由R-基团决定。
电荷计算：根据R基团在某一pH值时的解离状态确定； 等电点计算：同样，先写解离式，再根据pK值进行计算。 2.化学性质
α—氨基，α—羧基和R基团与游离氨基酸一样，同样有茚三酮反应，还有肽键特有的反应——双缩尿反应。 3.旋光性
短肽为各氨基酸的旋光度的综和，而长肽不等于其总和。 (三）、天然肽
有许多种生物活性：激素，抗生素等。 肽激素，α—鹅膏蕈碱，谷胱甘肽。 三、蛋白质一级结构测定
(一)、氨基酸序列分析的基本策略———重叠法 (二)、蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化
2、测定多肽链的数目 3、(亚基分离） 4、二硫键的拆分与保护
5、氨基酸组成分析 6、鉴定N-或C-末端残基
7、多种方法的部分水解和肽段分离
8、测序 9、重叠 10、确定二硫键的位置 1.N-末端测定
（1）二硝基氟苯（DNFB or FDNB)法； （2）丹黄酰氯（DNS)法;
（3）苯异硫氰酸酯（PITC)法； （4）氨肽酶（amino peptidase)法 2.C-末端测定
（1）肼解法（hydrazinolysis)法； （2）还原法（reduction);
（3）羧肽酶（Cardoxypeptidase)法 3.二硫键的切割与保护
1、过甲酸〔performic acid〕 不可逆 －CH2SO3H 2、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ SO3- R1-S- + R2-S-SO3 3、还原＋氧化 不可逆
[ 巯基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等 －S-CH2-COOH 4.氨基酸组成分析 1.酸水解； 2.碱水解； 3.氨基酸分析 5.肽键的专一性水解 酶水解
化学法: BrCN，NH2OH 酶法水解
6.N末端和C末端测序法 N末端：
1、Sanger法 DNFB 2、Edman法
3、Dansyl chloride/Edman组合法 4、酶降解法 C末端： 1、肼法
2、3H标记法 3、酶降解法 4、PFPA/PFPAA法
C末端的肼(hydrazine)法测定 C端的氚[3H]标记法测定 酶解法末端测序
利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase) 将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。 PFPA和PFPAA法C端测序
PFPA：pentafluoropropionic acid C2F5COOH PFPAA：Pentafluoropropionic acid anhydride
C2F5-COOOC-C2F5 这两种物质在酸性条件下低温反应，可以从C端一个接一个地切除氨基酸，与质谱相结合就可以确定C端多个氨基酸的序列。 7.肽段氨基酸序列的测定 Edman 降解法
氨基酸的鉴定、分离纯化
Edman降解与DNS-Cl法的结合 其它方法： 1.酶解法 2.质谱法
3.根据核苷酸序列推断 质谱法
Edman循环后看分子量的变化 7.二硫键位置的确定法
1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先 将自由SH基封闭。 2、进行专一性部分水解 3、纸层析分离水解产物
4、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层 析
5、将迁移率发生变化的多肽进行测序
N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。
四、蛋白质氨基酸序列与生物学功能的关系 （一）同源蛋白质的物种差异与生物进化 1.蛋白质的同源性（sequence homology) 2.不变残基（invariant residue) 3.可变残基（varible residue) （二）同源蛋白质的起源共同性 （三）蛋白质断裂与激活
第三章 蛋白质的三维结构
蛋白质的一级结构不具有功能，只有形成正确的结构才具有功能。二级结构以上的结构叫高级结构，由于高级结构是指各原子或基团在空间上的分布，所以又叫空间结构，或三维结构。
一、蛋白质的二级结构
（一）维持蛋白质空间构象的作用力 作用力 破坏因子
氢键： α-螺旋，β-折叠 尿素，盐酸胍
疏水作用： 形成球蛋白的核心 去垢剂，有机溶剂 Van der Waals力：稳定紧密堆积的集团和原子 离子键：稳定α-螺旋，三、四级结构 酸、碱 二硫键：稳定三、四级结构 还原剂 配位键：与金属离子的结合 螯合剂 EDTA （二）影响蛋白折叠的因素 1.二面角的转动
2.非键合原子之间的最小接触距离
3.侧链基团的空间位阻、电荷性质、基团间的相互作用等 二、典型的二级结构 1.α螺旋
右旋，3.6个氨基酸一个周期，螺距0.54 nm
第n个AA(NH)与第n-4个 AA(CO)形成氢键，环内原子数13。 氢键取向与主轴基本平行
1.α- 螺旋的结构特征：
Φ= -57o ;ψ=-47o ; 3.613-螺旋
螺距=5.4?；每个氨基酸上升1.5 ?,直径=5 ? 2. α- 螺旋的偶极矩和帽化 3. α- 螺旋的手性
α- 螺旋都是右手的，其旋光性是α- 碳原子的不对称性与α- 螺旋的构象不对称性的结合。
4.影响α- 螺旋的形成的因素： pH 的影响
一级结构与二级结构的关系（空间位阻，电荷效应，特殊结构，如脯氨酸）。 2. β折叠
β—折叠旋的结构特征：
Φ= —139o ;ψ=＋135o （反平行折叠） 主要存在于球状蛋白和纤维蛋白中 Φ= —119o ;ψ=＋113o （平行折叠） 主要存在于球状蛋白 β—折叠较为伸展。
3.β转角－－半圈3.010 螺旋 β-凸起
4、无规卷曲（randon coil)
指那些没有明确重复周期结构的“卷曲结构”，它并非是“无规”卷曲，而是有序的非
第三章 蛋白质的共价结构
