枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育
在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理微生物，使基因发生突变，可能导致微生物提高或者减低合成某一物质的能力。物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等。诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。用诱变剂处理微生物，一般要求微生物呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，处于该期的细菌对诱变剂最敏感。
必须选择合适的剂量进行诱变处理，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与3个因素有关：诱变源和处理微生物的距离、诱变源（紫外灯）的功率、处理的时间。前2个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。处理不同微生物的最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
本综合实验利用紫外线诱变枯草芽孢杆菌悬浮的菌体，分析不同参数下的紫外线致死率及诱变率，筛选产量提高的产淀粉酶菌株。学习物理因素诱变育种的方法，并掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，最终从诱变菌株中筛选出淀粉酶活力较高的菌株。
实验一 紫外诱变及高产菌株的初筛
（一）实验目的
通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 （二）实验材料与用品
菌种：枯草芽孢杆菌(产胞外淀粉酶)；
仪器：血球计数板，显微镜，紫外线灯（15W），电磁搅拌器，离心机。 （三）实验内容与方法 （1）菌悬液的制备
a) 取培养48小时的枯草芽孢杆菌的斜面4—5 支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并
倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。
b) 将上述菌液离心（3000r/min，离心 15 分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐
水洗涤2—3次，最后制成菌悬液。
c) 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升 108个。 （2）平板制作
将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。 （3）紫外线处理
1
a) 将紫外线灯开关打开预热约 20分钟。
b) 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液 5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿
中。
c) 将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为 30cm，功率为 15W的紫外
线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。
（4）稀释在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10 倍稀释法稀释成 10-1-10-6（具体可 按估计的存活率进行稀释）。
（5）涂平板取 10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板 3只，每只平板加稀释菌液0.1 ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。 （6）培养
将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养 48 小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 （7）计数将培养
48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 1分钟、3 分钟后的存活细胞数及其致死率。 （8）观察诱变效应
将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5—6 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。 （四）实验作业
记录实验数据，分析实验结果并进行讨论，撰写实验报告。
实验二 高产菌株的鉴定
（一）实验目的
1．掌握分光光度法测定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法； 2．从初筛所获得的诱变菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。 （二）实验原理
淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α-淀粉酶、淀粉1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。α-淀粉酶可以从淀粉分子内部切断淀粉的α-1，4糖苷键，形成麦芽糖、含6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可以用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消
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失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 （三）实验用品 1．粗酶液
实验一保存的HC比值大的菌落进行摇瓶发酵，发酵液离心后可作为粗酶液。 2．试剂
碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，贮于棕色瓶中；
比色用稀释碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500ml，贮于棕色瓶中；
2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸馏水混合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml，需当天配制；
pH6.0的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）4.523g，柠檬酸0.807g，用水溶解并定容至100ml；
0.5mol/L乙酸溶液。 3．器材
离心机，分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。 （四）实验方法 1．标准曲线的绘制：
表2－1标准曲线的制作
试 剂 淀粉稀释液浓度/% 淀粉稀释液/ml 缓冲液/ml
管号
1
2
3
4
5
6
0 0.2 0.5 1.0 1.5 2.0 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 40℃水浴中保温5min 1 1 1 1 1 1 蒸馏水/ml
40℃水浴中保温30min，加入0.5mol/L乙酸10ml，混匀后吸取反应液1ml
10 10 10 10 10 10 稀碘液/ml
A660
将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；
吸取淀粉稀释液2.0ml加至试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0ml，40℃水浴保温15min；
加蒸馏水1ml，40℃保温30min后加入0.5mol/L乙酸10ml； 吸取反应液1ml，加入稀碘液10ml，混匀，在660nm下测吸光值A； 以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。 2．酶液的制备
3
将发酵液离心（5000r/min，10min），取上清液作为粗酶液，以pH6.0缓冲液稀释至适当浓度，作为待测酶液。 3．淀粉酶活力测定
按下列程序操作：
试管A（空白） ↓
加2%淀粉稀释液2.00ml ↓
加缓冲液1.00ml（摇匀） ↓40±0.2℃，5min
加蒸馏水1.00ml（摇匀） ↓40±0.2℃，30min 加乙酸10.0ml ↓混匀
取反应液1.00ml ↓
加稀碘液10.00ml ↓混匀 测定A660
（五）注意事项
1．淀粉一定要用少量冷水调匀，再倒入热水中溶解，若直接加到热水中，会溶解不均匀，甚至结块。淀粉液应当天配制，配好的淀粉液应是透明澄清的，不能有颗粒状物质存在。 2．酶液应该进行适当稀释。 （六）作业 1．绘制标准曲线。
2．记录各样品的A660，并计算其酶活力，计算方法参见附录。 （七）思考题
1．测定酶活力时，在具体操作上应注意哪些问题？ 2．为什么测定酶活力的试剂要在40℃水浴锅中预热？ 附：
酶活力单位的定义：1 ml酶液在40℃、pH 6.0的条件下，每小时分解的淀粉的毫克数。表示为U/ml。
试管B（酶试样，需作三个平行试样） ↓
加2%淀粉稀释液2.00ml ↓
加缓冲液1.00ml（摇匀） ↓40±0.2℃，5min
加粗酶液1.00ml（摇匀） ↓40±0.2℃，30min 加乙酸10.0ml ↓混匀
取反应液1.00ml ↓
加稀碘液10.00ml ↓混匀 测定A660
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枯草芽孢杆菌产胞外淀粉酶高产菌株的选育讲义
