高效液相色谱—串联质谱法同时测定水产品硝基呋喃类代谢物残留
硝基呋喃类代谢物属于一种人工合成的广谱抗菌药物，它主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等.硝基呋喃类由于具有杀菌性而被广泛应用于畜禽和水产等动物传染病预防与治疗[13].该类药物半衰期短，在动物体内代谢速度快，与蛋白结合的代谢物产生稳定的残留，形成的代谢产物3氨基2噁唑烷酮（AOZ）、3氨基5吗咻代甲基2噁唑烷酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1氨基乙内酰脲（AHD）均可使动物发生癌变和基因突变，人类长期使用可对其健康产生危害[46]. 欧盟在1995年已全面禁止呋喃类抗菌药物作为生长剂和杀菌剂用在饲料中，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类药物的公告.由于硝基呋喃在动物体内代谢速度快，不容易在动物组织中被检测到，通过14C标记表明[7]，硝基呋喃代谢物在动物体内以蛋白结合物的形式存在，在体内能残留数周，这些结合残留物可通过在适当的酸性条件下释放出来，以达到检测硝基呋喃残留的目的[8].
由于液相色谱串联质谱方法灵敏度高，前处理方法简单快速，可同时用于产品的检测和确证，农业部颁布了相关的标准采用液质法应用于食品当中硝基呋喃类代谢物的残留检测[910].该方法操作简单，成本较低，回收率满足要求，但是由于水产品
成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质等杂质，前处理过程中没有采取进一步的净化，流动相溶解后会有乳化现象产生，容易产生基质效应，而且会对仪器造成污染影响结果的准确性，导致假阳性的情况出现.本文建立了水产品中硝基呋喃类代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，通过在前处理过程中采取固相萃取柱进行净化，减少样品带来的基质效应，提高了色谱分析的功效，简单快速，灵敏度高，而且节约成本，能够实现药物残留的快速检测，可以满足水产品质检以及相关基础研究的要求. 1实验部分 1.1仪器与试剂
Thermo TSQ Quantum液相色谱高分辨串联四级杆质谱联用仪（配用电喷雾离子ESI源）；旋转蒸发仪（瑞士布奇公司）；高速冷冻离心机（日本日立公司）；超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）；精密电子天平（梅特勒—托利多称重设备系统XX公司）；微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）.
标准储备液的配置：分别称取硝基呋喃类标准品各10.0 mg，用甲醇溶解后转移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L的标准储备液，在-18℃下避光保存.使用时将上述标准储备液混合，用甲醇稀释成0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L不同浓度的标准工作液.
内标储备液及使用液的配置：分别称取10.0 mg各内标标准品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L的标准储备液，在-18 ℃
下避光保存.准确吸取各内标储备液，用甲醇逐级稀释配成0.01 mg/L的混合内标使用液，在-18 ℃下避光保存. 1.2色谱质谱条件
采用电喷雾离子源（ESI）；喷雾电压：41 kV；离子传输毛细管温度：350 ℃；碰撞气氩气压力：0.1 Pa；鞘气流量：40 arb；辅助气流量：30 arb；扫描模式：多反应监测（SRM）；硝基呋喃类代谢物的母离子、子离子和碰撞能量见表2. 1.3样品前处理
称取2 g样品至于50 mL离心管中（精确至0.01 g），加入200 μL 0.01 mg/L的混合内标溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L盐酸溶液和0.2 mL 0.5 mol/L 2硝基苯甲醛溶液，在漩涡混合仪上充分混合1 min.置于恒温水浴振荡器中（37 ℃）避光振荡16 h，取出离心管冷至室温，加入5 mL 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.0～7.5，加入8 mL正己烷漩涡混匀后放入离心机离心10 min（6 000 r/min），分层后取下层水相待过柱，固相萃取柱（HLB，3 mL，60 mg）依次用3 mL甲醇，6 mL水活化，取备用液过柱，采用在大气压力下自然过柱.过完样品后，加入3 mL水淋洗并抽干.用4 mL乙酸乙酯分2次洗脱，洗脱液于40 ℃氮气吹干后，加入1.0 mL流动相溶解残渣，再加入2.0 mL正己烷放入离心机离心5 min（5 000 r/min），取下层液体过0.22 μm滤膜，滤液供液相色谱质联用仪测定. 2结果与讨论
2.1前处理条件的选择及优化
考察了甲醇与2 mmol/L的乙酸铵溶液不同体积比例（5∶95、10∶90、15∶85、20∶80）的混合液作为流动相时对目标物分析的影响，综合考虑目标物的响应值和出峰的时间、峰形的尖锐性，本文选择2 mmol/L的乙酸铵溶液：甲醇（V∶V=80∶20）为本实验的最佳流动相.由于水产品成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质.本文比较了在调节pH后加入8 mL正己烷离心和加入流动相后再加入2 mL正己烷离心2种不同的净化方式，这2种方式去脂的效果均不错，溶液也较澄清，但是第二种净化方式，回收率较低，在60%以下，第一种净化方式的回收率满足试验要求.
2.2固相萃取实验 固相萃取是一种色谱分离的前处理方法，主要依靠固相萃取柱来进行净化，不同的基质选择不同材料的固相萃取柱，填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低，本文比较了4种不同的固相萃取柱（C18 500 mg/3 mL，HLB 60 mg/3 mL，MCX 150 mg/6 mL，AluminaN 60 mg/ 3 mL）对硝基呋喃类代谢物的净化效果，其回收率的结果见图1，本实验选用HLB柱作为硝基呋喃类代谢物的固相萃取柱，回收率均满足要求.
固相萃取过程中的洗脱液一般选择甲醇、乙腈或者乙酸乙酯，本实验采用乙酸乙酯作为洗脱液，得到良好的洗脱效果.洗脱方式主要考察了一次4 mL、4 mL分2次以及9 mL分3次的3
种洗脱方式，从实验结果（表3）来看，当用4 mL乙酸乙酯溶液进行洗脱时，目标物洗脱不完全，还有部分目标物在组合SPE柱上没有被洗脱下来；当用分2次洗脱时（2×2.0 mL），目标物被完全洗脱，回收率良好；当用洗脱液分3次洗脱时（3×3.0 mL），回收率与2次洗脱淋洗时差不多，因此本实验选择操作简单、节约试剂的2×2.0 mL分2次洗脱的方式. 2.3色谱条件的选择及优化
流动相的pH值会影响目标物在色谱柱中的分离.本实验考虑采用挥发性电解质乙酸铵来做为流动相，同时加入0.1%甲酸控制流动相pH值，采用合适的梯度洗脱程序，不但很好地实现了各种目标物的分离，并且得到了比较理想的色谱峰，峰形尖锐且对称性好，增大了分子离子峰的峰强度.在8 min内，各种硝基呋喃类代谢物均得到了较好的分离.色谱图见图2. 2.4质谱条件的选择及优化
根据硝基呋喃类代谢物的结构特征，采用ESI正离子电离模式，以流动注射泵连续进样对1.0 mg/L的标液进行Q1全扫描，扫描范围为200～400 m/z之间，得到每种组份的分子离子，分别向其分子离子施以碰撞能量形成子离子，接着进行子离子全扫描，找出丰度最强的碎片离子为定量离子，丰度次强的碎片离子为定性离子.同时优化锥孔电压、碰撞能量、鞘气与辅助气流量等质谱条件，使母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳.得到1.2中最佳质谱条件.
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