实验一 乳酸发酵
【课前预习】
1．乳酸发酵的原理是怎样的？
2．泡菜和酸奶制作过程中应注意哪些事项？
【目的要求】
1．了解乳酸发酵的条件、产物以及参与乳酸发酵的微生物。 2．学习和掌握泡菜的制作方法。 3．学习和掌握酸奶的制作方法。
【基本原理】
微生物在厌氧条件下，分解已糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要是细菌，能利用可发酵糖产生乳酸的细菌称为乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和明串珠菌属（Leuconostoc）等。它们通常只在厌养条件下进行乳酸发酵，其发酵产生的乳酸，能够抑制一些腐败细菌的活动。
乳酸发酵很早就被人们所利用，应用十分广泛，如在畜牧业上利用乳酸发酵制造青贮饲料，在食品工业上可利用乳酸发酵腌制泡菜、制造酸奶，在发酵工业上还用纯种的乳酸细菌进生产乳酸等。乳酸细菌多是兼性厌氧细菌，但只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，故在筛选乳酸菌或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。
酸奶是鲜奶经过乳酸菌发酵而制成的乳制品，具备鲜奶的全部营养成分。酸奶含有人体必需的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、乳糖酶和活性乳酸菌等。酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质，经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。在发酵过程中，鲜牛奶中的酪蛋白遇酸凝固，成为有弹性的凝块，颜色乳白、气味清香、酸甜可口，别具一番风味。乳酸菌具有把奶类中的乳糖，分解成乳酸的功能，称为乳酸发酵。在形成乳酸的同时也产生其他一些酸类物质，从而导致了pH 值的下降，当达到乳类蛋白质的等电点时（如牛奶蛋白质的等电点约在pH4.5 左右），引起蛋白质的沉淀，使原来流动性较大的乳类，因凝固作用而变成类似果冻的胶状物，称之为“凝乳”。
本实验通过制作泡菜和酸奶，利用原料上天然存在的乳酸细菌进行乳酸发酵。我们可以通过镜检，初步判断泡菜中微生物的种类。
参照材料#
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【实验用品】
1. 试剂
10％H2SO4，2％KMnO4，含氨的AgNO3溶液，食盐。 2. 材料
四季豆，萝卜，辣椒，大头菜等。 3. 器材
泡菜坛，烧杯，试管，吸管，量筒，小刀， PH试纸，滤纸条。
【方法步骤】
1．泡菜腌制
（1）将萝卜、黄瓜、大头菜等洗净，连皮切成长方块儿（注意不要太小），放在架子上晒干；将生姜洗净，凉干；
（2）将泡菜坛洗净，用开水烫洗消毒；
（3）在烧杯中配制1000ml 8%的盐水，加热煮沸10min，盖住烧杯，冷却； （4）将晾干的瓜菜放入已经消毒的坛中，装量约为坛容积的1/2；
（5）将几瓣儿大蒜剥皮，切成厚片儿，再把一小块凉干的生姜也切成片儿，最后将姜片、蒜片和几个八角一起撒在瓜菜表面。这样可增加泡菜的风味儿，并有抑制杂菌的作用；
（6）将已冷却的盐水加入泡菜坛中，约至坛高的2/3处，然后加少许料酒。料酒同样具有增加风味和抑制杂菌的作用；
（7）盖上坛盖儿，并在坛口水槽内加水少许，以隔绝空气；
（8）置于30℃处发酵一周，其间请注意在坛口处补水，以保证坛内的厌氧环境。 2．乳酸的检测
（1）打开泡菜坛盖儿，闻坛中有无酸味儿或异味儿； （2）取少量泡菜水，用pH试纸测定其pH值；
（3）吸取10ml泡菜水注入空试管中，加入1ml 10% H2SO，再加入1ml 2％KMnO4，混匀。此时，试管中如有乳酸则会转化为乙醛；
（4）取一滤纸条，在含氨的AgNO3溶液中侵湿，并将其横搭在试管口上；
（5）将试管徐徐加热至沸，试管中如有乙醛就会挥发，管口的试纸将会变黑，即可证明泡菜水内含有乳酸。上述变化的化学反应方程式如下：
参照材料# 2
3. 酸奶的制作
（1）将脱脂乳和水以1:7～10(WW)的比例，同时加入5%—6%蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～5min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。
（2）将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2%～5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3～5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。
（3）把接种后的酸乳瓶置于40--42℃恒温箱中培养3～4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH4～4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。
（4）以品尝为标准评定酸乳质量，采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。
【实验结果】
乳酸细菌的镜检
（1）取一环泡菜水，在载玻片上制成涂片； （2）革兰氏染色；
（3）油镜观察。正常情况下，视野中多为革兰氏阳性的细长杆菌，也常有链球菌出现。 【注意事项】
1. 用于腌制的实验材料最好先晒至表面发蔫。
2. 牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。 3. 作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保存6～7d。
【思考题】
发酵酸乳为什么能引起凝乳？
参照材料#
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【实验报告】
1. 记录泡菜的制作过程，以及泡菜的外观、色泽、香味和口感； 2. 记录泡菜最终的pH值，以及是否检测到乳酸； 3. 绘制乳酸细菌的形态图。
参照材料# 4
实验一 乳酸发酵(特选资料)
