全自动核酸提取仪与手动提取组织DNA的效率比较
林丹义，张科平，许 洁，颜黎栩，骆新兰，刘艳辉 【期刊名称】临床与实验病理学杂志 【年(卷),期】2017(033)012 【总页数】2
【关键词】DNA提取；全自动核酸提取仪；手动提取 迈新·技术交流
近年，随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标志物的出现，以石蜡组织DNA为材料进行分子水平的基因检测及筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段。对于各种基因分析而言，重要的是能够获得足够纯度和数量的DNA[1]。DNA提取是分子生物学研究的一项基础技术，其提取的质量好坏及数量的多少直接影响到分子生物学实验的开展[2]。目前病理科所使用的DNA大部分为人工提取，使用全自动核酸提取仪提取DNA者占极少数。因此，本实验由两名分子实验室技术员独立完成对全自动核酸提取仪与手动提取核酸进行提取DNA效率的验证比较。
1 材料与方法
1.1 材料 随机选取广东省人民医院病理科存档的10例具有代表性的福尔马林固定石蜡包埋组织标本，包括手术标5例，小标本5例；肿瘤组织8例，非肿瘤组织2例。
1.2 试剂与仪器 石蜡标本DNA提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购于德国Qiagen公司，水浴锅(上海一恒科技公司)，低温离心机(Thermo Fisher Scientific)，QIAcube全自动核酸提取仪(Qiagen公司)，Nanodrop
2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific)。
1.3 方法 每例连续切片21张，5 μm厚，编号1～21，其中编号为双号切片用于手动DNA提取，单号切片用于全自动核酸提取仪提取。编号21玻片要求HE染色质控。切片贴于干净的载玻片上，置于75 ℃烤箱烤30 min。二甲苯脱蜡至水后，按照HE染色所选取的肿瘤区域，小心地用无菌刀片将组织刮入1.5 mL EP管中。加入200 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，吹打混匀，置于56 ℃的水浴锅中消化过夜。
1.3.1 手动DNA提取 将过夜消化的组织从水浴锅中取出，加入200 μL Buffer AL震荡混匀，置于70 ℃水浴锅孵育10 min，再加入200 μL无水乙醇充分吹打混匀，小心地转移至2 mL吸附柱中，8 000 r/min离心1 min，弃去废液，更换收集管；加入500 μL Buffer AW1，8 000 r/min离心1 min，弃去废液，更换收集管；加入500 μL Buffer AW2，8 000 r/min离心1 min，弃去废液，更换收集管；将吸附柱转移至干净的收集管中，真空离心12 000 r/min×3 min；将柱子转移至干净的1.5 mL EP管中，加入30 μL RNase Free H2O于膜中央，室温孵育3 min，8 000 r/min离心1 min，收集产物。
1.3.2 全自动核酸提取仪DNA提取 首先选择所需要的程序，根据程序的指引放置相应的tip枪头，放好DNA提取试剂，根据提示spin column和收集管置于适配器上，将前面所述的过夜裂解物放置在样本架上，确认每一步操作均无误后，关闭QIADcube门，运行程序。运行结束时，在触摸屏上会显示一个信息，确认样品已被处理，从转子适配器中取出含已纯化核酸的离心管。 1.4 DNA浓度及纯度测定 使用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度，分别记录浓度及OD260/OD280。
1.5 统计学分析 全部数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，组间数据统计用单因素方差分析。
2 结果
本组实验由两名操作者进行验证，操作者1手动提取DNA的总量为13 628.5±4 902.7，使用全自动核酸提取仪提取DNA的总量为9 121±3 264.3；操作者2手动提取DNA的总量为8 073.5±2 743.6，使用全自动核酸提取仪提取DNA的总量为6 181.5±2 135。上述结果提示，与手动提取DNA相比，全自动核酸提取仪提取DNA总量均较低，两者相比差异有统计学意义(P1=0.037，P2=0.030)。不同人员操作的全自动核酸提取仪提取的DNA总量差异无统计学意义(P=0.061)。不同人员手动提取的DNA总量差异有统计学意义(P=0.032)。OD260/OD280的比值波动范围保持在1.7～2.2。
3 讨论
近年来，随着分子生物学技术的发展，分子病理学应运而生，现已成为病理学科发展的重要方向。随着现代医疗模式进入个体化时代，许多遗传病、传染病及肿瘤的治疗已采用这一模式，如肿瘤的分子靶向治疗就是个体化医疗最好的体现。目前能进行靶向治疗的肿瘤种类越来越多，如淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、胃肠间质瘤、恶性黑色素瘤等，其基础就是建立在准确的肿瘤分子病理诊断上。影响分子病理诊断质量的因素有很多，归纳起来主要有标本质量、分子病理实验室建设、实验室技术员、病理医师的培训和分子病理诊断的规范化等。提取高浓度和高质量的DNA是临床分子病理检测的基本保证，随着分子生物学技术的快速发展，对福尔马林固定石蜡包埋组DNA提取的也要求越来越高，要求所提取的DNA浓度及纯度都要满足快速发展的分子病理
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