色谱联用技术

色谱联用技术

张玉慧

0942032216

摘要 近年来，色谱联用技术的不断发展和完善，在灵敏度和选择性等方面都有了很大的提

高，使得对复杂生物样品中药物及其代谢产物的测定变得更加准确，快速和简便，本文就近年来色谱联用技术在体内药物分析中的应用做一简要综述[1]。简述色谱联用技术如色谱一质谱联用、色谱一固相微萃取联用和色谱一色谱联用等技术的基本特点以及在药物及其代谢产物研究、天然药物化学成分分析及生物大分子分析等方面的应用[2]。

关键字 色谱联用技术；体内；药物；药物分析；中药 正文

1 色谱-质谱联用技术

色谱技术可为质谱分析提供纯化的样品，而质谱则提供准确的结果信息，素朴质谱的联用能够使样品的分离、定性、定量一次完成[3]。 1.1 气相色谱--质谱联用法（GC-MS）

气相色谱--质谱联用法（GC-MS）发展最早，技术也最完善。GC-MS 检测灵敏度高,但对样品的极性和热稳定性有一定要求，有时需要衍生化才能检测[4]。朱荣华等以地西泮为内标，用 GC-MS 法测定人血清中氯氮平及其代谢物。其采取程序升温，起始温度为 120℃，高于溶剂沸点而低于样品沸点，充分利用热聚焦效应改善峰形，同时避免了溶剂效应所引起的空间谱带展宽的负面影响[5]。Anderson 等采用 GC-MS 法同时测定癌症患者血浆中 5-氟尿嘧啶（5-FU）及其主要代谢物 α- 氟 -β 丙氨（alpha-fluoro-beta-alanine,FBA）：用Sep-pack C18 柱处理样品，方法最低检测限小于 1ng/mL（5-FU）和 5ng/mL（FBA）[6]。 1.2 液相色谱--质谱联用法（LC-MS）

液相色谱--质谱联用（LC-MS）是目前最重要的分离分析方法之一，HPLC 的高分离性能和 MS 的高选择性[7]，高灵敏度及丰富的结构信息相结合，已成为体内药物分析研究中强有力的工具。分析前样品预处理简单, 一般无需衍生化或水解, 更适合于体内药物的分离和鉴定。 Baumann等运用 HPLC-MS 法同时测定人血浆中环磷酰胺（CTX）及其4 种代谢物，方法最低检测限为 30ng/mL。谢智勇等以LC-MS-MS 法测定人血浆中地洛他定浓度，并研究地洛他定在中国男性健康人体内的药动学，结果地洛他定的线性范围为 0.2～40ng/mL，最低检测限为 0.2ng·mL-1[8]，日内及日间相对标准差（RSD）均小于 10%，该方法操作简便、快速、灵敏。 2 色谱--色谱联用技术

多维色谱技术应用于样品复杂组分的分析，提高了分离能力。多维色谱技术中常用的方法是二维色谱，即色谱色谱联用法[9]。其一般多指2 种色谱方法的联用，它将分离机制不同而又相互独立的两支色谱柱以串联方式结合起来，目的是用一种色谱法补充另一种色谱法分离效果上的不足。常见的联用方法有：气相色谱--气相色谱（GC-GC）联用法、高效液相色谱--气相色谱（HPLC-GC）联用法、高效液相色谱--高效液相色谱（HPLC-HPLC）联用法等。

其中HPLC-HPLC联用法亦称柱切换技术（CS），是指用切换阀来改变流动相走向和流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱入到分析柱的在线固相分离技术[10]。CS 技术具有以下优势：①分辨率和选择性高；②使待测组分密集，灵敏度高；③在一个色谱系统中，实现多个分离目标；④在线衍生化，灵敏度高，重现性好；⑤在线净化样品，使预处理过程自动化[11]。CS 技术近年来发展迅速，广泛应用于各种分析领域，尤其在体内药物

分析中应用最多。

待测物的极性是应用CS技术是所需考虑的最重要参数。低极性和中等极性的药物宜使用反相色谱法，选用中等极性的氰基柱和二醇键合柱，用水为预处理柱的流动相。极性高的组分用正相柱作预处理柱，待测生物样品需用大体积于水相溶的有机溶剂萃取后进样。

采用CS技术可使衍生化在线完成，不仅提高了分析的自动化程度，而且还有助于得到较好的精密度和重现性。张群艳等建立 HPLC 柱前衍生化结合柱切换技术测定血浆中卡托普利浓度的方法: 血浆中卡托普利与对溴苯甲基发生衍生化反应后,分别加入等体积的丙酮和水,离心后取上清液进样,以 HPLCL 柱切换进行分离测定,结果其线性范围为20～1 000 ng/mL ,方法回收率大于 98%，为卡托普利人体药动学研究和临床血药浓度监测提供了良好的方法。Tagawa 等在CS中引入微柱液相色谱技术，同时测定人体血清中胆固醇和胆固醇 3- 硫酸酯的浓度，采用紫外检测器和电化学检测器，检测限分别为 2.5 ng/mL和 295ng/mL。Yu 等用自动柱切换技术直接分离测定人血浆中甲氨蝶呤及其代谢物, 相对回收率大于94%,最低检测限为0.2ng/mL和 0.3ng/mL[12]。 3 高效液相--核磁共振联用技术

近年来，随着NMR仪在灵敏度、分辨率、动态范围等方面技术的提高，色谱，特别是 HPLC 与NMR仪直接联用已成为可能，并已经成为体内药物分析中有力的结构鉴定技术之一。

液相色谱--核磁共振联用技术（HPLC-NMR）能一次性地完成从样品分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析。但这种分析手段目前还存在检出限高、不能分析太大分子等缺点。含量较少的组分可以进行NMR累加扫描，甚至作二维谱图，以得到更大量的结构信息[13]。

目前HPLC-NMR联用进行体内药物分析研究主要集中于对尿液中的代谢产物的研究。Spraul第一次报道了使用 HPLC-NMR 研究药物代谢，将服用了布洛芬受试者的尿液冷冻干燥处理后，分别用连续流动和驻流操作方法进行分析，并在驻流操作时作了二维谱得到了代谢产物的明确结构。从此 HPLC-NMR 在药物代谢研究中的应用得到迅速的发展。 4 色谱和原子光谱技术的联用

液相色谱最大的优点是无需衍生即能直接分离，简单快速，且分离效率高，而原子光谱联用具有多元素同时选择性检测能力，成为在元素形态分析中极为有效的方法之一。尤其是具有较好应用前景的热喷雾化器接口，它是由一个石英气化管的雾化器和一个适合微柱田LC的去溶装置组成，拥有较高的雾化效率和其所要求的流速适合等离子体对有机溶剂的要求等特点，解决了HPLC-ICP-AES联用的难题[14]。目前HPLC-ICP-AES已成功应用于海

洋生物中飚的化学形态分析。Rubio等利用Hamilton PRPX-100分离含A5(Ⅲ)，AS(V)，二甲基次胂酸钠及甲基胂酸二钠的水样，洗脱物用低压汞灯辐照，K2S208氧化，经NaBH4还原成舡飓测定。Emteborg开发了微孔柱离子色谱与塞曼效应石墨炉原子吸收(ETAAS)联用技术，将以80“L／min低流速的色谱流出物用小体积液体定量收集杯收集存留，定时将定量杯中试样注入ETAAS检测，很好地解决了连续过程和间歇过程，使用该装置测定生物样和水样中的硒化合物绝对检出限低于0.1 ng，与HPLC-ICP-MS检出限相当。

氢化物发生气化进样技术也较广泛用于As、Se、Hg等九种元素的原子吸收光谱、原子荧光光谱和ICP-AES的测定，与相应的气动雾化器相比，在ICP-AES中氢化物法的检出限可低2个数量级，生成的氢化物从溶液中分离出来消除了常规LC-ICP-AES联用中存在的基体干扰。贾志刚等人采用断续流动HG-AFS测量了补硒制剂康必硒中的Se(Ⅳ)，Se(Ⅵ)和总硒，从总硒中减去Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的含量为有机硒含量。研究表明，阳离子表面活性剂CTAB能显著提高测定硒的灵敏度，降低检出限，并提高测量的精密度及干扰离子存在的允许量116J。Kathryn等利用半胱氨酸作为预还原剂，在线微波消解HPLC-HG-AAS系统分离并测定了生物样品中的无机砷、砷甜菜碱(ASB)二甲基砷酸(DMA)、单甲基砷酸(MMA)以及总As。Villa-Lojo等也利用PRP-x100阳离子交换柱测定了鱼样品中的各种砷形态。由于汞在氢化物发生试剂

的作用下很易形成汞蒸汽，Xin等用流动注射一高效液相色谱一冷蒸汽原子吸收光谱(FI-HPLC-CVAAS) 定生物样中的甲基汞、乙基汞、苯基汞和汞(Ⅱ)的方法，检出限均达ng／L，方法简单，灵敏度高[15]。Gomez-Ariza等运用阳离子交换的HPLC-HG-AFS联用进行了As(Ⅲ)、As(V)、MMA、DMA的形态分析，检出限分别为0.17、0.38、0.45、0.30微克/L。而对于不与氢化物反应的AsB，则在经过离子交换后通过在线紫外光解(UV)后原子荧光测定。BraInanti等采用在线紫外二极管阵列一反向高效液相色谱一冷蒸汽原子荧光色谱(LC-DAD-CVGAFS)测定了氨基酸等生物样品中的无机汞(Hg(Ⅱ))、甲基汞(MeHg)、乙基汞(EtHg)和苯基汞(PhHg)，其检出限分别为16 pg、18 pg、18 pg和20pg，R.S.D范围在1.5～2.0％。经色谱柱分离出的三种有机汞，以HCl为介质的KBr/KBr03在线氧化为无机汞，而Hg(Ⅱ)则由硼氢化钠还原为Hg测定[16]。

在形态分析中常使用的等离子检测器是微波诱导等离子体(MIP)，以极高的温度破坏分子结构成为元素形态，通过光学发射光谱有选择性的测定不同形态的元素。Landaluze等用GC-MIP／AES联用技术分析了河流沉积物和鱼中的汞和甲基汞。分析的检出限为5 ng／L，测量精密度为2.7％。样品在2 mol／L的硝酸或10％的甲醇KOH中磁搅拌90 min，滤液中甲基汞的分子结构不会被破坏；混合液经离心机分离，取上清液4.9mL，加5mLpH4.8的醋酸，1 mL0.1％的NaB(C2H5)4和1 mL己醇，振荡10 min；有机相上GC-MIP／AES联用机 分析。此外，Botana等对该检测器在金属形态分析中的运用已作了很好的总结，此处不再赘述[17]。 5多维色谱

多维色谱是采用多种色谱系统实现理想分离的方法[18]。高速逆流色谱(high-speed

counter-current chromatography,HSCCC)由于其不需要固定相，理论上能保证样品的100％回收。我们将HSCCC与UPLC-QTOFMS联用，快速筛选藤黄(gamboge)中诱导细胞凋亡的成分。具体做法是先用HSCCC将样品分离成不同的组分，将所有组分进行HeLa-C3细胞凋亡活性测试，对有活性的组分进行UPLC-QTOFMS分析，最后鉴定出诱导HeLa-C3细胞凋亡活性活性成分gambogenic acid。

结语

近年来，色谱联用技术取得了较大进展，由以往仅少数专家进行研究的方法逐渐发展成为一种常见的应用技术。随着色谱联用设备的普及，色谱联用技术将在食品、药品、生物、环境工程、大气化学和石油化工等诸多领域拥有十分广阔的应用前景。

色谱联用技术在体内药物的分离鉴定、体内外代谢产物及药物作用机理方面有着广泛应用。特别是高效液相质谱联用技术在体内药物及其代谢产物的定量研究中发挥了重要作用，一些方法已经用在临床药物的筛选中。近年来，新方法、新技术的联用提高了检测的灵敏度和选择性，分析自动化程度提高，分析时间缩短。在体内药物分析领域中，高效液相--质谱联用以及高效液相--核磁共振联用等技术起了不可替代的作用。随着高效液相联用技术日趋成熟及其普遍应用，今后必将在体内药物分析中起更大的作用。

对于体内药分工作者来说，进一步将高效液相与其它各种新型的技术如气相色谱、傅里叶变换红外光谱、固相微萃取技术联用推广应用于体内药物分析测定中，将会给体内药物分析学科的进展开拓出广阔的发展天地。

现代色谱联用技术的分离和在线鉴定功能使中药复杂体系的质量控制变得方便和快捷，已越来越多地应用于基于“全成分”分析为基础的中药质量控制的各个方面，相信随着这类高尖端仪器的不断普及，自动化程度的不断提高，研究工作的不断探索和积累，能体现中医药整体观的基于真正的全成分分析的中药控制体系必将为中药的现代化做出贡献。

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