RTPCR／Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn4mRNA的表达变化

RT-PCR／Southern杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马Brn-4 mRNA的表达变化

作者：董传明 秦建兵，金国华，王 磊，朱蕙霞，田美玲

【摘要】 目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内Brn-4 mRNA表达的差异。方法：42只SD大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后1、3、7、14、21及28 d 组。取各组大鼠的海马组织，提取总RNA，采用RT-PCR/Southern 杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA的表达变化。结果：海马内Brn-4 mRNA的表达量在切割后第3 d开始升高，14 d达到最高水平，随后下降，28 d左右恢复至正常水平。结论：切割穹窿海马伞后海马内Brn-4 mRNA表达明显上调，可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关。

【关键词】 穹窿海马伞切割；海马；Brn-4；逆转录聚合酶链反应；Southern 杂交；大鼠

[Abstract] Objective: To investigate the difference of Brn-4 mRNA expression between the fimbria fornix transected rats and normal ones． Methods: 42 SD rats were randomly divided into 7 groups，6 rats in each group．One group served as normal control

and the others served as the 1st，3rd，7th ，14th ，21st and 28th day group after fimbria fornix transection, respectively. Then hippocampi were isolated and total RNA was extracted. RT-PCR/Southern blot was used to detect the change of Brn-4 mRNA expression in hippocampus after fimbria fornix transection. Results: The expression level of Brn-4 mRNA started to increase on the 3rd day after fimbria fornix transection．The peak appeared on the 14th day，and then the expression decreased slowly to pre-transection level on the 28th day. Conclusion: The process that the expression of Brn-4 mRNA increases significantly after fimbria fornix transection, perhaps，might be related to the transplanted or endogenous neural stem cells differentiating into neurons in hippocampus．

[Key words] Fimbria fornix transection；Hippocampus；Brn-4；Reverse transcription-PCR；Southern blot; Rat

我们在近年的研究发现，将神经干细胞分别移植到切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马中，神经干细胞在切割侧海马中更易于存活、迁移和向神经元分化[1，2]。体外诱导分化发现，切割穹窿海马伞侧的海马提取液促进神经干细胞向神经元分化的作用也明显强于正常侧海马提取液[3]。提示切割穹窿海马伞后，海马中某些诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的物质表达增强。 新近我们还证实切割穹窿海马伞后也能促进切割侧海马中的自体神经干细胞向神经元分化。POU同源盒基因在中枢神经系统的发育过程中起重要作用，已证实其家族成员Brn-4作为重要的转录因子在胚胎纹状体神经干细胞向神经元分化过程中起调控作用[4]。本文使用RT-PCR/Southern 杂交方法观察了切割穹窿海马伞后不同时间点大鼠海马Brn-4 mRNA表达量的变化，以期阐明Brn-4的表达变化与海马中植入的或自体的神经干细胞向神经元分化的相关性。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 SD大鼠42只(南通大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重220～250 g，随机分成7组，其中1组为正常对照组，其余6组分别为切割穹窿海马伞术后1、3、7、14、21和28 d组，每组6只。

1.2 切割大鼠穹窿海马伞 上述各组大鼠，经腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent(0.2 ml/100 g)麻醉后，固定于立体定位仪，暴露前囟，确定前囟坐标A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)，根据Paxinos图谱确定左右两侧穹窿海马伞的切割范围。先在颅骨上确定右侧两点即(1)A1=A-1.4、L1=L-4和(2)A2=A-1.4、L2=L-4；左侧两点即(3)A3=A-1.4、L3=L+1和(4)A4=A-1.4、L4=L+4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧(1)和(2)、左侧(3)和(4)点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即V1－4=V+5.4，来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，动物按性别分笼饲养。

1.3 RNA的提取 正常对照组及术后各组大鼠经上述方法麻醉后，断颈处死，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体,证实两侧穹窿海马伞被切断后,取出两侧海马组织,置匀浆器中,加入1ml Trizol(BBI公司)充分匀浆，提取RNA。测OD260/280值，经甲醛变性电泳鉴定RNA质量，-70℃保存备用。

1.4 RT-PCR 选用磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参照。反应中所用Brn-4上游引物为：5′-GGGTGACCAGTCTTAGCGAC-3′，下游引物为：5′-GCGAGTACACATTGAGGGGT-3′，扩增产物为237 bp；GAPDH上游引物为：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物为：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，扩增产物为452 bp。（1）逆转录：使用逆转录试剂盒(BBI公司)，以所提取的RNA为模板逆转录得到cDNA；（2）PCR反应：将目的基因与内参基因的引物置同一管内行PCR扩增，反应体系按试剂DNA聚合酶(MBI公司)说明书操作。预变性94℃，3 min，94℃，40 s、54℃，30 s、72℃，45 s，32个循环；最后延伸72℃，10 min；（3）琼脂糖凝胶电泳及半定量分析：取PCR扩增产物10