《现代药学实验技术》课程作业
目录
1.高效液相色谱技术..................................................................................................... 1
1.1 高效液相色谱分析原理.................................................................................. 1 1.2 仪器设备.......................................................................................................... 1 1.3 使用范围.......................................................................................................... 1 1.4 注意事项.......................................................................................................... 1
1.4.1 柱的使用和维护注意事项.................................................................... 1 1.4.2 泵的使用和维护注意事项.................................................................... 2
2. 高效液相色谱技术在药学研究中的应用............................................................... 2
2.1 高效液相色谱技术在中药研究中的应用...................................................... 2
2.1.1 中药材指纹图谱的研究........................................................................ 2 2.1.2 中成药的分析........................................................................................ 3 2.1.3与药效学相结合的应用研究................................................................. 3 2.2 高效液相色谱技术在药物分析中的应用...................................................... 4
2.2.1 基本分析方法........................................................................................ 4 2.2.2 体内药物分析的特点............................................................................ 4 2.3 高效液相色谱技术在药品检验中的应用...................................................... 5 2.4 高效液相色谱—质谱联用技术在药学研究中的应用.................................. 5 3. 高效液相色谱技术在其他领域的应用................................................................... 5
3.1 高效液相色谱技术在食品检测中的应用...................................................... 5 3.2 高效液相色谱技术在环境监测中的应用...................................................... 5 4. 展望........................................................................................................................... 6 参考文献........................................................................................................................ 6
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高效液相色谱技术及其应用
高效液相色谱自20世纪70年代间世以来，经过近40年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟，现在已成为化学学科中最有优势的分离分析方法之一。高效液相色谱的应用范围十分广泛, 几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。具估计，目前已知的化合物中，有80%的化合物需要用高效液相色谱法进行分离分析。此外，对无机物的分析也有很好的效果，特别是对生命活性物质的分离分析，有着其他分析方法不可替代的作用，已广泛应用于石油化工、生物化学、临床医学、食品卫生、环境监测、医药工业、商品检 验、地质勘探、油田开发等领域的分离分析[1]。
1.高效液相色谱技术
1.1 高效液相色谱分析原理
高效液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程, 他借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离[2]。
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1.2 仪器设备
HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC 仪还备有自动馏分收集装置[2]。
1.3 使用范围
高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析[2]。 1.4 注意事项
1.4.1 柱的使用和维护注意事项 （1）避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
（2）选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。
（3）避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预
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处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。
（4）经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。
（5）保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
（6）每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗。装在HPLC 仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5 天开机冲洗15 分钟。
1.4.2 泵的使用和维护注意事项
为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：
（1）防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
（2）流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。
（3）泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
（4）输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
（5）流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。
2. 高效液相色谱技术在药学研究中的应用
2.1 高效液相色谱技术在中药研究中的应用
中药历史悠久, 源远流长。中药不仅是我国医药体系中独具特色的重要组成部分, 也是西方医药,特别是植物药、天然药物的有机组成部分。众所周知, 中药防治疾病的物质载体是其所含有的化学成分群。因此, 中药化学成分分析一直是其药效物质阐明及质量控制的关键。但由于中药化学成分的复杂性, 中药成分分析存在诸如分离难度大、分析时间长等问题。近年来, 快速高效液相色谱分离技术的发展与成熟有效地弥补了传统的高效液相色谱(HPLC)分析中存在的不足, 使中药化学成分分析进入了高效、高通量的阶段[3、4]。 2.1.1 中药材指纹图谱的研究
中药材的指纹图谱的研究是中药国际化、标准化的必由之路。利用HPLC技术进行中药的标准化，建立药材或中成药特征的色谱或光谱的图谱是一种有效的方法。如王花红[4]等对中药山茱萸药材的括纹图谱的研究中，采用相关系数法计算不同样品指纹图谱之问相似度，结果表明指纹图谱相似度大小与药材品质有关。洪波[5]等对中药附子进行指纹图谱研究，使药物中生物碱较好分离，确定了附子的七个共有峰，可用于附子的鉴别及质量监控。王艳[6]等通过对三七高效液
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相指纹图谱特征峰的重现性和稳定性研究和相似度计算(分别以夹角余弦、相关系数和欧氏距离为测度)，结果表明:21个三七样品的相似度均在0.9~1，其,常见伪品的相似度均低于0.9，该方法可作为评价三七质量的高效液相色谱指纹图谱。 2.1.2 中成药的分析
中成药提取物在给定实验条件下所得到的HPLC色谱指纹图谱反映了该中成药中各单味药所含的化学成分或经配伍变化后所得的化学成分及其含量的分布状况，根据指纹图谱中各个色谱峰的位置，大小及分布情况，可推断出该中成药所含的成分是否完全及含景有多少等详细信息。许波[7]等用HPLC法测定脑通注射液中芍药苻的含量，结果芍药苷在43.9~219.5μg/ml。呈良好的线性关系(r=0.9996)，精密度RSD为0.23%(n=7)，重现性RSD为1.331％(n=5)，芍药苷的平均回收率为99.9％，RSD为0.72％(n=6)。杨薇[8]等在选定的色谱条件下对不同批号葛洒及不同品牌葛粉进行测定。结果表明：葛酒中的葛根素含量在91.33～I83.28μg/ml之间，且含量较稳定。葛粉中的葛根素含量在0.01％～0.11％之间，不同品牌之问葛根索含量相差悬殊。覃沽萍[9]等采用HPLC法检测复方扶芳藤合剂中发现，l0批样品的HPLC指纹图谱中，各批号样品共有指纹峰的相对保留时间比较吻合，但部分批号个别峰相对对峰面积波动较大；认为可能是生产所用原料各批次间存在差异，如原料产地、采收、加工等不同导致了原料中各组分的含量存在差异所致。
2.1.3与药效学相结合的应用研究
颜晓华[10]等采用高效液相色谱荧光法测定兴奋性氨基酸脑组织谷氨酸（Glu）和抑制性氨基酸γ氨基丁酸(GABA)含量变化，来研究黄芩甙埘新生鼠脑血肿继发脑水肿的治疗。结果表明黄芩甙能减轻实验性脑血肿继发的脑水肿。黄芩甙对实验性脑血肿继发性脑水肿的保护作用可能与黄芩甙通过抑制兴奋性氨基酸(EAA)大量释放，同时大量增加抑制性氨基酸以拮抗兴奋性氨基酸Glu的神经毒性作用有关。王琳[11]等用HPLC—电化学法测定药物对动物的影响结果显示，消疲怡神口服液可以拮抗应激所致血清多巴胺(DA)、5—羟色胺(5—TH)含量升高和肾上腺抗坏血酸含量降低，使下丘脑垂体低下的5—TH、去甲肾上腺索(NE)水平回升，同时还可纠正应激所致的免疫功能抑制。
随着中药产业的不断发展和科学技术的进步，人们对分析分离技术提出了更高的要求。对于液相色谱分析, 不仅需要有好的准确性, 也要求有更高的 分离效率，特别是当测试对象数目庞大时，分析效率便显得尤为重要。超高压液相色谱、基于整体柱的高效液相色谱及高温液相色谱方法是色谱分析新的发展领域，它既具有液相色谱的高选择性，又具有气相色谱的高分离效率。通过改变固定相粒径、使用整体材料填充、升高系统温度，分析时间可大大缩短，但仍可保持非常好的分析效果。超高压液相色谱、基于整体柱的高效液相色谱及高温液相
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色谱方法目前正处于快速发展阶段，尽管还存在一些问题,但可以相信，随着仪器和色谱柱技术的不断完善，其必将在中药研究中发挥重要的作用，为中药的现代化、国际化提供必要的技术支撑。 2.2 高效液相色谱技术在药物分析中的应用
高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，引入气相色谱法的理论和实践技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而完成的现代液相色谱分析方法。HPLC具有同时分离和分析的功能，对于体内药物分析和体内内源性物质的分析及成分复杂的重要分析尤为重要，色谱分离后排除了干扰，大大提高了分析测定的选择性和准确性。HPLC 的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备，也适合于一些微量成分和痕量成分( 如杂质或代谢产物) 的分析。
医药分析包括对药物含量主成分的含量测定，以及对各种可能存在的杂质、分解产物等微量成分的鉴别和分析，及药品质量标准中的定性、定量和杂质检查测定，还包括对药物的开发研究至生产阶段的每个环节进行质量追踪，同时还包括药物代谢产物的分析、鉴定以及临床治疗药物的监测和体内物质的分析、测定。HPLC 在西药的分析中应用于质量控制，尤其表现在微量成分和痕量成分的分析。而在中药材鉴定和质量分析上也越来越重要，它的应用将促进我国中药质量的标准化和规范化[12]。
高效液相色谱法在体内药物分析中具有样品处理简便、快速，标准曲线的线性较好，精密度和灵敏度均能够符合药动学研究和治疗药物监测的需要的优点。而且，HPLC 能同时进行分离和定量测定，这在治疗药物监测和药代动力学中应用极为广泛。 2.2.1 基本分析方法
类型：（1）定性分析：既包括有效成分或主要成分的定性鉴别，也包括杂质的鉴别，在体内药物分析中还包括各种代谢产物的鉴别。（2）定量分析：包括上述各种组分的定量测定。（3）杂质限度实验。
分类：（1）定性分析方法：①色谱鉴别法；②化学鉴别法；③光谱鉴别法。（2）定量分析方法：①峰高和峰面积；②外标法；③内标法；④内加法。（3）药物杂质总量限度测定法。（4）制备型高效液相色谱法。 2.2.2 体内药物分析的特点
被测定的药物和代谢物的浓度极低；样品介质复杂，其中存在各种各样直接或间接影响测定结果的物质，大多需要分离和净化；仅有少量样品可供分析，尤其是在连续测定过程中，很难再度获得完全相同的样品；样品的稳定性需要特别 注意。
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高效液相色谱技术及其应用.总结
