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实验一 普通光学显微镜的使用及其对微生物一般形态的观察
一、实验目的
1．了解普通光学显微镜的构造及其各部分的作用。 2．掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。
3．通过低倍镜、高倍镜观察藻类、酵母培养液和新鲜活性污泥中微生物的一般形态。
二、实验原理
普通光学显微镜由机械部分和光学部分组成。
图1-1 双目生物显微镜
1．机械部分：
（1）镜筒：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入目镜，下面与转换器相连。
（2）转换器：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的物镜。
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（3）载物台：载物台是放置标本的方块平台，中央有透光孔，载物台上面有玻片夹持器，侧面有移动手轮，可纵向和横向移动标本。
（4）调焦手轮：包括粗调手轮和微调手轮，可使载物台上下升降，调节物镜和标本之间的距离。
2．光学部分：
（1）目镜：放在镜筒上，配有10倍（10×）、16倍（16×）两种。 （2）物镜：装在转换器的孔上，有低倍镜（4、10）、高倍镜（40）和油镜（100），是显微镜中最主要的部分。各种镜头上都刻有放大倍数和数值孔径（N?A）及所要求盖玻片厚度等主要参数。物镜的性能由数值孔径决定，并且还依赖于物镜的分辨率。
（3）聚光器：由聚光镜和孔径光阑组成。聚光镜的作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。孔径光阑是用来调节对比度的，使物镜和聚光器的数值孔径相符合。当孔径光阑开启到物镜出瞳的70~80%时，就可以得到足够对比度的良好图象。如果开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果开得太小，则分辨率下降，降低物像的清晰度。
（4）电光源：在显微镜的下部，提供观察标本时所用光源。 三、实验器材
1．普通光学显微镜（双目生物显微镜） 2．载玻片、盖玻片若干 3．玻璃棒、滴管 4．滤纸、擦镜纸
5．藻类、酵母培养液，新鲜活性污泥
四、实验方法
１．低倍镜的操作
（１）首先把目镜放入镜筒上，将物镜（4、10、40、100）旋紧在转换器上。
（2）标本放在载物台上，用玻片夹持器挟紧。并用移动手轮移动所要观察的目的物到圆孔的正中央。
（３）打开电源开关，调整聚光器，使光路对准载物台中央的光孔，光亮度要适宜。 （４）旋动转换器，将10倍物镜对准光孔。
（5）用粗调焦手轮使物镜与标本距离至最小，同时要侧脸观察，以免压坏标本玻片或损坏物镜。
（6）调节瞳距。
（7）眼睛接近目镜观察，左（右）手用移动手轮轻轻移动玻片夹持器，右（左）手用粗调焦手轮将载物台下移（向内旋转调焦手轮），如果见到目的物，但不是十分清楚，再用细调焦手轮调节，至目的物清晰为止。
（8）如果粗调焦手轮旋得太快，超过焦点，必须从第（5）步重调，不要在正视目镜的情况下调粗调手轮，防止没有把握的旋转使物镜与载玻片相撞碰坏。
注：观察时两眼同时睁开，双眼不感觉疲劳。 2．高倍镜的操作
（1）使用高倍镜前，先用低倍镜观察（操作方法同低倍镜的操作）。
（2）旋动转换器，换用高倍镜（40）观察，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜观察没有调准焦距，目的物没有找到，须用低倍镜重新调节。如果调节正确，换用高倍镜时基本可以看到目的物，如果模糊，用微调焦手轮稍微调节一下就清晰可见。
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3．微生物形态观察 取一干净的载玻片，用滴管或玻璃棒在培养液内沾一滴菌液，用干净的盖玻片覆盖在滴液上（注意不要有气泡）即成标本片，用低倍镜和高倍镜观察。记录微生物的形态特征。
四、实验记录及结果
表1-1微生物的形态观察记录
项 目 低倍镜观察 高倍镜观察 放大倍数
五、思考题
1．镜检标本时，为什么要先用低倍物镜观察？ 2．画一个细胞结构的示意图。
实验二 微生物的计数（酵母菌的显微镜直接计数）
一、实验目的
1．了解并掌握常用的血球计数板的构造。 2．学会一般的显微镜直接计数方法。
二、实验原理
测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petroff Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。
血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（图2-1）。每个方格网共分9大格，其中间的一大格（称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成（图2-2）。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的间隙为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
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