选考加试部分 第十二章 生物技术实践 第30讲 微生物的利用
浙江[学考＋选考]考纲确认 考点 知识内容 加试 掌握程度参考考试标准的：二、(二) 3.实验与探究能力 一、微生1.大肠杆菌的培养和分离 物的利用 2.分离以尿素为氮源的微生物 考点一| 大肠杆菌的培养和分离
1．微生物的实验室培养 (1)培养基
①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
②成分：一般都含有碳源、氮源、水和无机盐，还需要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(2)无菌技术
方法
煮沸消毒法??消毒?化学药剂消毒法??紫外线消毒法
???
?
灭菌?干热灭菌
?高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
(3)实验操作
牛肉膏蛋白胨固体培养基的制备： 计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
2．细菌的分离方法：划线分离法和涂布分离法 (1)划线分离法
①方法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，使聚集的菌种分散到培养基的表面。每个菌落就是一个细菌产生的后代。
②应用：用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因(如抗氨苄青霉素基因)，如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌和其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。
(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到10－7～10－5倍，然后取0.1 mL稀释度不同的菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。
3．大肠杆菌的培养和分离
(1)大肠杆菌特点：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。 (2)细菌的繁殖：以二分裂的方式繁殖，分裂速度很快。
(3)细菌的扩大培养：用LB液体培养基，划线分离用LB固体平面培养基。 (4)大肠杆菌的分离操作技术
最常用方法是划线分离法，其操作步骤是：
①培养基灭菌：将刚配制好的50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基分别装入两个250 mL的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。
②倒平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。
③接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角瓶的液体培养基中，
三角瓶在37 ℃，每分钟200转的摇床中振荡培养12 h。
④划线分离：将摇床上培养12 h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37 ℃恒温培养箱中进行培养，12～24 h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已经分离。
⑤菌种保存：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37 ℃下培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
1．消毒和灭菌的区别 项目 条件 较为温和的消毒 物理或化学方法 结果 仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 常用的方法 煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法 灭菌 强烈的理化杀死物体内外所有的微灼烧灭菌、干热灭菌、因素 生物，包括芽孢和孢子 高压蒸汽灭菌 2．几种消毒和灭菌方法及其适用范围 类型 煮沸消毒法 消毒方法 紫外线 灼烧 灭菌方法 高压蒸汽灭干热灭菌 房间、仪器设备 巴氏消毒法 适用范围 日常生活 不耐高温的液体 操作方法 100 ℃煮沸5～6 min 70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min 擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源 紫外线照射30 min 化学药剂 生物活体、水源等 接种工具、接种时用直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼的试管口或瓶口等 耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等 烧 物品放入干热灭菌箱，160～170 ℃加热1～2 h 培养基、培养皿等，高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，
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