第三章 FlowJo分析多色标记样本
多色标记样本，包含双标记、三标记及以上的样本。多色标记样本分析的原则是把多色标记简化为单标记或双标记。多色标记样本在采集或数据处理过程中需要做荧光补偿。在FlowJo中的数据显示方式是二维点图。二维点图能够显示两个独立参数与细胞相对数之间的关系，横坐标和纵坐标分别代表与细胞有关的两个独立参数，平面上的每一个点表示具有相应坐标值的细胞。一般来说可以由一个二维点图得到两个一维直方图，但是由于多个细胞具有相同二维坐标现象的存在，所以二维点图的信息量要大于两个一维直方图的信息量。二维点图在设十字门之后被分成四个区域，实验目的不同，各个区域所代表的含义不同。本手册提供参考的是三标记样本的分析步骤。只要灵活掌握分析技巧，根据实验需求学会把多色分析简化，这样就可以做到事半功倍的效果。
一、由原始数据生成二维点图的过程
原始数据：为FlowJo演示数据，选择3-color-experiment文件夹中的931115-B02-Sample01.FCS进行分析演示。
1. 打开软件，将“3-color-experiment”文件夹拖入FlowJo工作台。
2. 在样本空间中双击“931115-B02-Sample01.FCS”样本，出现图形窗口，显示为二维点图。X轴选择FSC，Y轴选择SSC。然后选择多边形设门工具在二维点图中选中淋巴细胞。如下图所示：
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3. 双击淋巴细胞门，出现图形窗口，X轴选择Fluor::CD3，Y轴选择FSC。使用矩形设门工具
选中CD3阳性细胞，设门并命名为T细胞
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4. 双击T细胞门，出现图形窗口，在X轴选择Cy5PE::CD4，Y轴选择PhyEry::CD8，使用十字门工具
设门，如下图所示：
Q1：CD8单阳性细胞，为CD8+ T细胞 Q2：双阳性细胞
Q3：CD4单阳性细胞，为CD4+ T细胞 Q4：双阴性细胞
四分门更改门位置的方法：
单击四分门“十字”的交点选中这个四分门，如下图所示。拖动鼠标将四分门移到目标位置。
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二、二维点图的设门原则
二维点图常用四分门来设门，四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处。
三、多色标记分析说明
多色样本分析在实验中具有重要的地位，很多用户对多色分析感觉无从下手。其实，流式分析中结果的显示一般都是一维和二维的。因此，在流式分析中无论是几色标记的样本，只要把多色的分析简化为单标记和双标记的分析，问题就会迎刃而解。
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比如：检测TREG需要标记CD4/CD25/FOXP3，可以用SSC vs. CD4的二维点图，把CD4+的细胞圈出来。然后用CD25 vs. FOXP3的二维点图，把CD25+/FOXP3+的细胞表示出来。这样就可以把CD4+/CD25+/FOXP3+的TREG细胞辨别出来。上面的实例就是把三标记的样本转化为两个二维的点图进行分析。
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