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Wistar大鼠EAE模型的制备
作者:刘颖 刘华 辛晋敏 马太花 梁丽云 马存根 摘 要 目的:检测EAE中起关键趋化作用的MCP-1的表达,探讨山西医科大学动物室的Wistar大鼠诱导实验性变态反应脑脊髓炎动物模型。方法:采用免疫诱导方法制备EAE模型并HE染色,同时用原位杂交法检测EAE大鼠MCP-1的表达。结果:免疫后12d~17d,发病鼠出现EAE临床症状,HE染色,光镜下可见血管周炎性浸润,MCP-1的表达明显增加。结论:山西医科大学Wistar大鼠成功的诱导实验性变态反应脑脊髓模型是可信、可用的。
关键词 完全抗原;Wistar大鼠;EAE;MCP-1
多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)是中枢神经系统(CentralNervous System,CNS)的炎性脱髓鞘疾病,多发于20岁~40岁女性,大多数患者的病程为复发和缓解交替,在复发期常出现视力受损、肢体无力、平衡失调、麻木、感觉异常、口齿不清、眩晕、大小便机能失调等症状。MS病因和发病机制复杂,一般认为与免疫、病毒感染、遗传等因素有关。实验性变态反应性脑脊髓炎(ExperimentalAu-toimmune Encephalomyelitis,EAE)的病理变化及发病机制与急性MS极其相似,因此,成功的建立EAE模型对MS的研究有很重要的意义。本实验的研究可为后期的研究工作提供基础。 1 材料与方法
1.1 试验材料 Wistar大鼠:购自山西医科大学动物实验室。原位杂交试剂盒:购于武汉博士德生物制品公司。
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1.2 方法
1.2.1 完全抗原的制备:取液体石蜡40mL,羊毛脂20g混合、加热并融化制得不完全弗氏佐剂(In-complete Freund'sAdjuvant,IFA),分装入10mL小瓶,高压灭菌后4℃冰箱保存。健康350g~450g左右雌性豚鼠用3%戊巴比妥45mg/kg腹腔注射至四肢瘫软。无菌状态下,剪开胸腔、剥离心包,0.01mol/L PBS左心室灌注直至肝脏变白;迅速取其脑脊髓,小心剥离脑脊膜后称重,加入等量生理盐水,制成50%(W/V)匀浆。同时融化IFA,1mL IFA加入约10mg的M.bovisBCG即制得CFA。将CFA与GPSCH等体积混合,用注射器反复抽推,制成油包水乳液,制成完全抗原,放置冰上备用。
1.2.2 模型制备:将健康、雌性Wistar大鼠30只,随机分成正常对照组、佐剂组和EAE组,三组大鼠左后肢足垫皮下分别注射完全抗原0.4mL/只,百日咳原液0.05mL/只(含5.0×10 9 个菌体)。记免疫当日为零天,每天称重,采用双盲法两人进行临床症状评分,取平均值,临床评分2分为发病动物,临床评分采用通用的五分评分法,即:0分无症状,1分动物尾部肌张力降低,2分动物尾部麻痹+后肢肌张力低,3分尾麻痹+后肢肌张力重度低,4分尾麻痹+四肢麻痹,5分频死状态。发病动物只数/实验动物只数为发病率。免疫后12d~17d,3%戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射,至四肢瘫软,无菌状态下,剪开胸腔剥离心包,0.01mol/L PBS左心室灌注至肝脏变白;4%多聚甲醛灌流至尾部僵直,解剖迅速取其大脑视交叉前后2mm组织、小脑和脑桥部、脊髓颈腰膨大处,再用4%多聚甲醛固定半小时,做常规石蜡包埋、切
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片。
1.2.2 HE染色:按常规方法进行。
1.2.3 ISH染色:参照试剂盒中的方法进行。 2 结果
2.1 EAE发病动物的临床评价 EAE组的发病率为91.6%;临床症状评分为3.46±1.45,最高临床症状评分达5级,毛色差,全身皆瘫,只有呼吸存在;EAE组的体重减轻可达(30.91±12.85)g。正常大鼠和佐剂组均没有发 病,正常大鼠体重呈持续增加,而佐剂组体重几乎没有变化。EAE鼠在免疫后12d~17d发病产发病前毛色发暗,活动较少,食欲较差;发病时,临床评分随着时间延长加重,临床症状有多种形态,例如:单侧偏瘫、头向一侧瘫、视力明显下降类似与人的MS的多种情况;发病后,症状减轻,食欲开始增加,体重恢复等。 2.2 病理检测 在临床症状出现之前,EAE大鼠和佐剂组、正常大鼠一样,CNS中几乎找不到典型的血管周炎性细胞的浸润,也找不到其他病理上的改变。当出现临床症状时,CNS内有典型的血管周炎性细胞的浸润。随着病情的增加,炎症病灶的范围和细胞浸润的程度也相应增加,临床症状评分为3级的典型EAE动物仅在腰膨大处发现EAE典型的血管周袖套样炎性细胞浸润;3级以上者,可在视交叉区域及大脑的皮质、皮髓交界处甚至深部髓质,脑脊膜和侧脑室周围都有大量的EAE典型的血管周袖套样炎性细胞浸润;临床表现不一样的动物,血管周袖套样炎性细胞浸润的部位、程度、范围、数量也不一样。在缓解期间,临床症状减轻、消失的动物,CNS内典型的病理变化也相应减轻或消
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失(图1)。
2.3 原位杂交结果 正常大鼠和佐剂组的MCP-lmRNA阳性细胞数为4±2,EAE组为36±30,方差分析:F=15.81,P=0.0001<0.01,差异非常显著。q检验:EAE组MCP-1mRNA阳性细胞数与正常对照组、佐剂组分别比较均有统计学上的差异(P<0.01),正常大鼠与佐剂组之间没有统计学上的差异(P>0.05)(图1)。 图1 正常大鼠、EAE大鼠HE和ISH染色×400 略 3 讨论
EAE是自身免疫性疾病MS的理想动物模型,EAE模型的诱导与多个因素有关系,比如:①动物的类型、品系、年龄,性别;②所用的抗原纯度、类型、计量、物理形态和注射方法;③佐剂的来源等。通过总结其他人的实验方法,本实验摸索出一个针对山西医科大学Wustar大鼠EAE实验模型的制作:动物发病率高,稳定,为本实验室的后期工作提供了一个非常宝贵的经验 [1] 。
EAE模型的发病机制与MS的类似:髓鞘蛋白反应性CD4+Thl活性增高,导致Thl细胞因子(尤其IFN-7是一种关键性的因素)上调;疾病的免疫细胞要经过趋化、粘附、生物膜的降减等作用才能进入CNS,在EAE或MS中,与这些活动有关的细胞因子MCP-1、ICAM-1MMPS等一般都上调;此外,NO可对神经元也起抑制性细胞毒作用。
其中MCP-1是β类趋化因子家族的一个成员,Godiska等曾发现:MCP-1表达广泛分布在脊髓 [2] ,在主动免疫的C57BL/6MCP-1-裸鼠会产生效应性T细胞,但没有出现EAE临床症状,将这些细胞转
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染给野生鼠配体,这些配体出现EAE特有的临床症状;同样野生型鼠的效应性T细胞主 动转染MCP-1-裸鼠也不出现EAE大鼠临床症状,这是由于MCP-1-裸鼠缺乏MCP-1基因,无法介导效应性T细胞进入CNS [3] 。本实验中发现:正常大鼠和佐剂组MCP-1mRNA阳性细胞数少,而所有EAE组MCP-lmRNA阳性细胞数却都很高,MCP-1参与了EAE的病理过程,作为EAE疾病的关键性趋化因子,可作为实验指标。 参考文献
[1] 刑清和,王永铭,郑荣远.影响EAE动物模型建立的因素分析[J].中国临床神经科学,2000,8(4):305~306.
[2] Berman JW,Guida MP,Warren J,et al.Localization Of mono-cyte chemoattractantpeptide-1expression in the central nervous system in experimental autoimmuneencephalomyelitis and trauma in the rat[J].Immunol,1996,156(8):3017~3023. [3] Huang D-R,Wang J,Kivisakk P,et al.Absence of mono cyte chemoattractant protein1in mice leads to decreased local macrophage recruitment and antigen-specific T helper cell Type1immune
response
in
experimental
autoimmune
encephalomyelitis[J].J Exp Med,2001,193(6):713~726.