MTT实验法测定细胞增殖
1.实验材料
1.1. 实验细胞株
癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。
1.2 药物与试剂
RPMI-1640 培养基 DMSO 胰蛋白酶粉
1-甲基乙内酰脲 5-氟尿嘧啶 MTT 粉 甘油 碘化丙啶(PI) 新生小牛血清 1.3 仪器设备
超净工作台（SW-CJ-2FD 型） 超低温电冰箱 恒温水浴箱 低温高速离心机 恒温震荡摇动床
-20℃电冰箱 光学显微镜 电子天平 Eppendorf 移液枪（10、100、1000ul） 去离子纯水仪 流式细胞仪 低温数控高速离心机 普通离心机
1.4 主要试剂配方 1.4.1 PBS 溶液
磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为 1.0L。再使用盐酸将 PH 值调至 7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。临用前要在 37℃水浴加热。
1.4.2 细胞培养基
称取 RIPM-1640 培养基粉 10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入 2g NaHCO3，再用盐酸将 PH 值调整至 7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于 4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为 10%。每次临用前要将含有 10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640 培养基置于 37℃水浴箱中加热。
1.4.3 新生小牛血清
临用前，将新生小牛血清置于 56℃水浴中灭活 30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。
1.4.4 胰蛋白酶
在 100ml 的 PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉 0.25g，置于 4℃冰箱中过夜，用直径为 0.22μm 微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于 4℃冰箱中保存。
1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml)
往 50ml 无菌 PBS 中加入 250mg MTT 粉，轻轻摇匀，使 MTT 粉充分溶解，予用直径为 0.22μm 微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于 4℃冰箱中临时保存（≤7 天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1 月）。
1.4.6 4%多聚甲醛
称取多聚甲醛 4g 溶于 50ml 蒸馏水中，然后加热至 70℃左右，用玻璃棒搅拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入浓度为 1mol/L 的 Na0H 至溶液澄清，冷却，蒸馏水定容至 100ml，用盐酸将 PH 调至 7.2，锡箔纸避光，置于 4℃冰箱中保存。
1.4.7 苏木精染液
蒸馏水 700ml，甘油 300ml，苏木精 5g，碘酸钠 0.5g，冰醋酸 20ml，硫酸铝钾 500g。
1.4.8 伊红染液
蒸馏水 100ml，伊红 0.5g，氯化钙 0.5g。 1.4.9 1-甲基乙内酰脲溶液的配制 1-甲基乙内酰脲（M）分子式为 C4H6N2O2，分子量为 114.10，纯度>99.0%，吸取适量该药物，加入少量 PBS 或生理盐水（PH7.4），配制成 500 mg·L-1的母液。-20℃保存，临用时稀释。
1.4.10 5-Fu 溶液的配制
5- 氟尿嘧啶（ 5-Fu ）分子量为 130.08 ，分子式为 C4H3FN2O2，规格为250mg/10ml，pH 值为 8.4～9.2，吸取适量该药物，加入少量 PBS 或生理盐水（PH7.4），配置成 100mgL的母液。-20℃保存，临用时稀释。
2.实验方法. 2.1.细胞培养 2.1.1.细胞复苏
(1)从-80℃冰箱迅速取出冻存人结肠癌 SW480 细胞的冻存管，然后迅速投入37℃水浴箱中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内容物迅速融化，取出后用 75%酒精消毒，放入无菌操作台，在操作台中开启冻存管。用 1000ul 的移液枪吸出溶解的细胞悬液，注入离心管，同时往离心管中加入 10 倍 10%灭活新生小牛血清RPMI-1640 培养基，准备离心。
(2) 室温下，1000 rpm，离心 5min，用移液枪吸取离心管中上清液、弃去，然后用细胞培养液洗 1～2 次，弃去上清培养液后，加入 1ml 培养液，用吹打管轻轻吹打，使离心管底部的细胞悬于培养基中，形成悬浮液。
(3)用培养液适当稀释悬浮液后，用移液枪将细胞悬液接种到 100ml 的无菌培养瓶，盖好瓶盖，将接种有人结肠癌 SW480 细胞的培养瓶放入饱和湿度、5%CO2、温度为 37℃培养箱中培养，24h 后更换培养液，放入培养箱中继续培养，观察细胞的生长状况，待细胞生长状态基本恢复正常后，取对数期细胞进行实验。
2.1.2.细胞传代
(1)在普通光学显微镜下观察观察细胞的生长状况，当细胞在培养瓶贴壁面生长融合达 70%～80%时，弃去培养液，然后用 PBS 液洗 1～2 遍。
(2) (2)用 0.25%胰酶细胞消化液，于室温或 37℃下消化铁壁细胞数分钟，边消化边在显微镜下观察细胞的形态变化，当 70%细胞的胞膜发生皱缩，细胞体积变小、细胞变圆时，往培养瓶中加入 10%灭活新生小牛血清的 RPMI-1640 培养基4～5ml，终止消化。
(3)用弯头吸管反复吸取瓶内培养液吹打培养瓶的细胞贴壁生长面，吹打时确保培养瓶底部各个部位都要吹打到，动作轻柔，幅度不要太大，使贴壁细胞脱
落形成细胞悬液。
(4)按实验所需细胞浓度接种，分成 2～3 个培养瓶，置于饱和湿度、5%CO2、温度为 37℃培养箱中继续培养。
2.1.3.细胞收集
(1) 在室温或 37℃下，用 0.25%胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。 (2)用移液枪将培养瓶中细胞悬液移入 10ml 离心管，常温下 1000rpm，离心5min，弃去上清液，再加入 5ml PBS 洗涤 2～3 次。
2.1.4.细胞计数
(1) 在室温或者 37℃下，用胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。 (2)取盖玻片、计数载玻片各一块，先用 PBS 清洗干净，再用 75%酒精反复擦拭计数载玻片和盖玻片，然后风干，盖上盖玻片，用 10ul 移液枪吸取细胞悬液 5μl 由盖玻片一侧缓慢的滴入计数载玻片中，使载玻片和盖玻片之间均匀的充满细胞悬液体。
(3)在用 10×物镜显微镜下，观察计数载玻片上四角计数格内所含细胞的总数X。计数原则：细胞压中线时，数上不数下，数左不数右，细胞团块合计为一个细胞。
(4)将计数所得细胞总数代入公式，得出细胞密度＝X/4×104个/ml（细胞数/毫升原液）。
2.1.5.细胞冻存
(1)选择对数期生长的细胞冻存，用浓度为 0.25%胰蛋白酶消化液把培养瓶中的贴壁细胞消化下来，把已经消化好的细胞根据细胞传代的方法收集起来，同时细胞计算，之后将收集的细胞加到离心管，1000rpm，离心 5min，去上清液。
(2)往离心管中加入冻存液，将细胞密度调整为(5～10)×106个/ml。冻存液的配制：甘油、胎牛血清按体积比 1:9 的比例均匀混合。
(3) 将离心管中含有细胞的冻存液分装到冻存管，每个冻存管加 1～1.5ml含细胞液， 在 4℃冰箱中放置 30 分钟，转入-20℃的冰箱中放置 2h 后，再放入-80℃冰箱 24h，最后转入液氮罐中保存。
2.2 MTT 比色法检测 1-甲基乙内酰脲、5-Fu 及两者联合对 SW480 细胞增值的抑制作用
2.2.1 实验分组：分为四大组：对照组（等量PBS）、1-甲基乙内酰脲组(M)、5-Fu-、 甲基乙内酰脲与5-氟尿嘧啶联合组(M＋Fu)。
2.2.2 1-甲基乙内酰脲对 SW480 细胞的增值抑制作用 根据文献数据和预实验，将 1-甲基乙内酰脲组设八个浓度组：M0.5mg·L-1、M5mg·L-1、M10mg·L-1、M20mg·L-1、M50mg·L-1、M100mg·L-1、M200mg·L-1、M500mg·L-1。各组分别干预人结肠癌 SW480 细胞 24、48、72h，MTT 法检测1-甲基乙内酰脲对 SW480 细胞增殖抑制作用。 以上实验各组设置 6 个平行孔，实验重复三次，分析比较各组细胞增殖抑制率有无统计学差异。
2.2.3 检测 1-甲基乙内酰脲及 5-Fu 分别对 SW480 细胞增殖的抑制作用 根据文献数据和上述实验结果，将 1-甲基乙内酰脲和 5-Fu 各设四个浓度组。
1-甲基乙内酰脲为 M 10mg·L-1、M20 mg·L-1、M50mg·L-1、M100mg·L-1四个浓度，5-Fu 为 Fu 10mg·L-1、Fu20mg·L-1、Fu50mg·L-1、Fu100mg·L-1四个浓度。1-甲基乙内酰脲和 5-Fu 各设的四个浓度组药物浓度相同，有利于两者效果比较分析。根据文献数据和上述实验结果，选择各组药物干预 48 小时后，
MTT实验法测定细胞增殖
