二次谐波显微成像技术
微观世界的很多有用信息可以通过采用显微技术获得，显微成像技术在生命科学、医学、工业测量等不同领域有着巨大的研究价值和广泛的应用，因此，显微成像技术一直是人们研究的热点。非光学显微术，如电子显微技术、扫描隧道显微技术等，存在对观察样品环境要求严格、对观察对象造成伤害、对观察样品限制较多等弱点，而光学显微术没有这些弱点缺陷，因此，光学显微术的发展完善和功能拓展具有重要意义。近年来，计算机技术、激光技术和精密机械电子等技术得到飞速发展，随着这些技术的提高，出现了激光共焦扫描显微成像技术、双光子激光扫描共聚焦显微成像技术、光学相干层析成像等很多种不同功能和特性的现代光学显微术。二次谐波显微成像技术是其中的一种现代非线性光学显微术，它利用光与物质相互作用时产生的二次谐波信号进行显微成像或探测。 一、二次谐波显微成像原理
在非线性光学过程中，在强激光作用下的非线性介质，其电极化强度与激发光场的关系可以表示为：
二次谐波产生过程是和频过程的一种特殊情况，即倍频。倍频效应是指两个频率相同的入射光发生和频作用，其输出光波的频率为入射光场频率的二倍，其中入射光波称为基频，输出倍频光波称为二次谐波。相应的极化强度为：
二次谐波产生过程也可以看作是不同频率光子的交换过程。两个频率为ω的光子在谐波产生过程中湮灭，同时生成一个新的光子，频率为2ω。
二次谐波产生需要满足两个条件：一是要求介质要具有非中心对称性。在电偶极子近似下，具有中心对称性的介质，其二阶电极化率张量为零，则不能产生二次谐波信号。二是要求满足相位匹配条件。相位匹配直接决定一个非线性光学过程的效率。如果二次谐波产生过
程中完全满足相位匹配条件，则传播中的倍频光波和不断产生的倍频极化波之间保持相位的一致性，相互干涉，产生的二次谐波强度由零开始逐渐增大，直至基频波的功率完全转为二次谐波的功率，获得最大的二次谐波输出功率。
二次谐波显微成像装置由四个部分组成：第一部分是光源，通常需要提供功率适中的激发光，既可以保证产生较强的二次谐波信号，也可以避免样品受损。在二次谐波显微技术中光源通常采用可在整个红外区内可调谐的掺钛蓝宝石飞秒激光器。第二部分是物鏡，可以减小激发光的激发区域，并收集样品产生的非轴向辐射的二次谐波信号，避免能量损失。通常采用数值孔径足够大的物镜。第三部分是滤光片组，可保证收集到的信号为二次谐波信号，过滤干扰信号。在前向探测模式中，通常采用短通滤光片和窄带滤光片，在背向探测模式中，通常采用窄带滤光片。第四部分为信号探测系统，可以进行二次谐波信号的收集探测。通常采用高灵敏度的PMT探测器，或与激发光源同步的信噪比高的锁相放大器。 二、二次谐波显微成像技术特点
不同于其他的现代光学显微成像技术，二次谐波显微成像技术由于利于样品的非线性特性产生的二次谐波信号进行成像和探测，因此，具有以下主要特点：
1.传统的激光共焦显微镜采用共焦小孔成像，二次谐波显微成像产生的信号光由于非线性效应的强局域特性被局限在焦点附近很小的区域里，在成像过程中非焦点区域发光对测量结果的影响大大减小，因此，它不采用共焦小孔就可以实现高分辨率成像，还具有较高的信噪比，具有较高的三维空间分辨率，并且可以对具有一定厚度的样品进行层析成像。
2.在二次谐波显微成像技术中，通常激发光源采用近红外的飞秒激光器，这样减小了对生物样品的光损伤，降低了光漂泊，增加了样品的穿透深度。
3.二次谐波信号是样品的原发性信号，成像过程不需要使用染料
进行染色，这样避免了光化学毒性及染色过程中的物理损伤，没有染色过程也使该技术可用于很多被测样品不能进行荧光标记的成像探测。
4.利用二次谐波信号进行成像或探测时，二次谐波信号的相干性使其对样品局部微观结构具有较高的敏感性，因此探测到的二次谐波信号不仅能反映与样品有关的强度信息，还可以反映样品的分子取向、排列方式等局部微观结构，这些重要而本质的信息可以通过分析信号的角度分布或偏振特性等得到。
5.二次谐波显微镜虽未商品化，但双光子荧光显微系统已经商品化，二次谐波成像显微镜可以很容易地在其基础上经过简单改造获得，如通过更换滤光片改造而成，耗费较小。
6.二次谐波成像显微镜可以收集背向信号，可以和其他的成像技术进行同时探测，如双光子荧光显微镜、光学相干层析成像，实现多通道显微成像或探测，更加有利于进行成像结果对比研究，实现信号互补。
三、二次谐波显微成像技术的应用
在生命科学领域，二次谐波显微成像技术由于其无光损伤、无光毒性、无光漂白等特点，在生物组织成像中有广泛的应用。研究表明，一些结构蛋白如胶原蛋白、肌动球蛋白复合、微管蛋白等，都具有很强的二次谐波信号，不同的胶原蛋白类型在同等激发条件下，呈现不同的二次谐波信号强度，因此二次谐波显微成像技术可以用于生物组织的结构蛋白成像。生物细胞和组织成像也可以通过二次谐波显微成像技术实现，Shi-Wei Chu等人曾用此技术观察到了斑马鱼体内细胞分芽繁殖、原肠胚的形成、组织的形成等晶胚发育过程。Andrew等人用苯乙烯基染剂产生二次谐波信号，研究发现其对膜电压的敏感度达到40/100mV。二次谐波成像可以实现膜之间分离距离的测量，测量的精度比其他显微镜都高。不仅如此，根据二次谐波信号对分子分布的对称性的依赖，可以实时观察膜上分子的动力学变化规律，这比通常使用的核磁共振更加方便快捷。因此二次谐波显微技术在膜成像
二次谐波显微成像技术
