PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定
中的应用
2006年第4期(总第105期)广西热带农业45 PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用 宋卡魏王星云张荣意
(华南热带农业大学环植学院,海南儋州571737)
摘要:PCR及其相关技术用于体外扩增DNA,RNA具有灵敏,快速,简便等优点,已经广泛应
用于植物病原细菌的检测.本文综述了real—timefluoreseentPCR,REP—PCR,Irlq~luno—RCR,RAID—
PCR,Nested—PCR等技术的原理及其在植物病原细菌检测和鉴定中的应用现状. 关键词:PCR植物病原细菌检测鉴定
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是 1983年由美国PE_Cetus公司的KaryMullis等n发 明,1985年公开报道的一种体外核酸扩增系统.PCR 及其相关技术具有快速,灵敏,操作简便等优点,已广 泛应用于分子生物学,医学,微生物学等领域.且在这 些领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前 景.传统的PCR技术在植物病原细菌学的检测应用已 经非常广泛12,3,4,5,61但是由于植物病害的多样性以及 植物病原细菌的复杂性,使传统的PCR技术较难满足 需要,由此专家学者们研制出了许多以PCR技术为基 础的相关技术,如Real—timefluorescentPCR,rep— PCR,~nnluno—PCR,ITS—PCR等.这些方法使植物病 原细菌的检测更加方便,快捷,灵敏,本文简要介绍一 些PER相关技术的原理及其在植物病原细菌检测中 的应用概况.
1Real—timefluorescentPCR
其原理是在常规PCR的基础上,增加1条双荧光 标记的核酸杂交探针,即Taqman探针;随着实时PCR 反应体系的进行,每进行一次DNA扩增,就有一个探 针被切断,同时荧光信号值被记录下来,且与扩增产物 的量产生一对一的对应关系,产物的量越大,荧光信号 就会越强,也即反应起始的模板数越高,就越容易达到 一
个荧光信号阈值,循环次数(Ct值)和反应体系的底 物浓度就会形成一个严格的对应关系,根据标准曲线 和Ct值,即可以准确地确定扩增基因的浓度…. 实时荧光PCR在全封闭状态下实现PCR扩增. 荧光探针杂交,信号检测不需电泳和EB染色,可以有 效地降低污染和假阳性的产生,具有操作简单,省时省 力,精确性高,特异性强,安全快速,准确灵敏等优点. 漆艳香等硌将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基 因克隆测序,根据该细菌与其它待测细菌菌株16s rDNA序列差异,设计出对玉米细菌枯萎病菌具有稳 定点突变的特异性探针.进行实时荧光PCR检测,结 果显示只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,且灵敏度 较高,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR 就能检测到.根据此技术原理与路线,漆艳香等又分 别构建了苜蓿萎蔫病菌,菜豆细菌性萎蔫病菌Bo]和 香蕉细菌性枯萎病菌…的实时荧光PCR检测体系. 朱建裕等n根据梨火疫细菌中独特含有质粒pEA29, 设计了1对引物和3条探针,建立了梨火疫细菌实时 荧光PCR的检测方法. 2REP—PCR
原核与真核生物中普遍存在着散布的重复DNA
序列,这些序列由于发挥着生物体基本的功能作用, 因此在进化中呈高度保守的状态.REP(repetitiveeX- tragenicpalindromic)和ERIC(enterobactefialrepetitivein- tergenicCOl2Sensus)属于这样的序列.研究发现,REP, ERIC等序列在微生物中广泛存在,随机分布且在进 化中呈高度保守状态.因此,研究人员以REP,ERIC 等序列为引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳得到不同带型,从而形成 了被测菌基因组特异的指纹图谱,该技术称rep—PCR DNA指纹技术.该技术方法简单,快速,敏感和分辨率 高,现普遍应用于流行病学中的致病菌株鉴定和确定
广西热带农业2OO6年第4期(总第105期) 细菌间的亲缘关系.
S.V.Tsygankova等\对Xanthomonas,pseudumonas, Erw/n/a等病原菌进行鉴定时,发现所有被测的. campestr/s均能通过引物KRPN2扩增出一段约600bp 的片段,接着用引物SCAR进行扩增,在所有的. ~tr/s上出现一条特异性条带,而在其他的被测菌 株上不能出现.他利用这特点,进行rep—PCR,结果 能有效,迅速地对被测菌株进行鉴定.J.Louws等[14在 对339个Xant~monas进行鉴定时,也成功地应用了 rep—PCR技术获得理想结果.
在日本,Ralstoniasolanacearum小种4和小种1 广泛存在于西红柿,马铃薯等植物上,除非进行致病 性测试,否则很难将两者区分,MitsuoHorita等\】人利 用小种4中存在特异性序列(AKIF—AKIR)和(21F一 21R),并将其作为引物,利用rep—PCR技术,最后得 到了特异带型.该方法能够准确,快速,灵敏地进行致
病菌株的鉴定. 3Immuno—PCR
免疫PCR是在酶联免疫吸附实验基础上建立起 来的一种新方法,由Sano等【I酬在1992年首次报道,它 同时具备抗原抗体反应的专一性和PCR的强特异扩增 能力.它是将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗 体复合物上,用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显 色,根据扩增产物存在与否判断抗原存在情况.其一般 程序是这样的,首先在酶联板上包被捕获抗原的抗体, 然后加入待检抗原,再加入DNA分子标记的检测抗 体,温育后充分洗涤,PCR扩增黏附于抗原/抗体复合 物上的DNA分子,最后对PCR产物进行分析[17]o 在该项技术的基础上,张红【l.等采用了免疫磁珠 吸附与PCR相结合的技术,对瓜类细菌性果腐病病原 快速检测,经研究表明,其技术检测时间周期为4h, 最低菌悬液检出量为1×10cfu/ml,而且不需进行细 菌DNA提取.该技术方法省时,快捷,准确,估计会在 口岸检疫工作中起到重要的作用. 4RAPD—PCR
RARD技术由W////ams和Welsh首先提出 (W////ams等1990),是利用一个随机序列的寡核酸作 引物,通常为10个核甘酸,以生物基因组的DNA作模 板进行PCR扩增反应,扩增产物经聚丙烯酰胺或琼脂 糖凝胶电泳分离,所得多态性可反映基因组DNA相应 区域的多态性,因而可用于对不同类群细菌和不同致 病变种亲缘关系的鉴定,系统进化发育的研究等等. 姬广海等n用4o个引物对中国水稻条斑病菌, 稻短条斑病菌和李氏禾条斑病菌等14个代表菌株进 行了RAPD分析.HocquelletA等】应用RAPD方法检
测了柑桔黄龙病亚洲种与非洲种基因的多态性并获 得4个鉴别基因.XiaotingQia等在研究柑橘和咖啡 上的致病菌Xylellafastidiosa时,发现传统的PCR法较 难鉴别,他们应用了RAPD—PCR法,扩增产物存在 Cf0I多态性,利用这特点较好的鉴别了该致病菌. Khoodoo等也充分使用了该方法,对天南星科等植 物的细菌性枯萎病病原物不同致病变种Xanthomonas axonopodispv.dieffenbachiae进行遗传多态性分析,从而 进行鉴定. 5Nested—PCR
巢式PCR(nestedPCR)是一种PCR改良模式,它 由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成,首先对靶 DNA进行第一步扩增,然后从第一次反应产物中取出 少量作为反应模板进行第二次扩增,第二次PCR引物 与第一次反应产物的序列互补,第二次PCR扩增的产 物即为目的产物.
王茂华等根据玉米细菌性枯萎病病菌ITS区域 序列,选择特异性序列,设计了一对引物,该引物能从 参试菌株中扩增出特异性条带,然后与扩增ITS区域的 通用引物结合,建立了检测和鉴定该病菌的nested— PCR技术,该技术检测灵敏度达到了4个细菌细胞.吴 琼等在研究该病菌时,通过对该病原菌及其近似种 的16SrDNA的序列测定和分析,设计了该病原菌的特 异性引物,最后采用nested—PCR技术,准确区分了该 病菌及其近似种,且检测灵敏度在DNA水平上达到 10ng,检测纯培养细菌达到2CFU/ml的水平. 6展望
PCR及其相关技术的进步极大的促进了植物细 菌病害研究的发展,为植物细菌病害的研究注入了新
PCR相关技术在植物病原细菌检测和鉴定中的应用
