1 液相色谱基础知识 1.1 液相色谱名词术语
Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。 Detection wavelength：检测波长，
retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间 Peak:峰
Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴 Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离
Peak Width at Half Height：半峰高宽 Peak Area：峰面积
Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰
Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰 Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰 Baseline Drift:基线漂移 Baseline Noise:基线噪音
Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象.
1.2 流动相 1.2.1 流动相类型
正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物，极性大的组分先出柱（现在大部分液相用的是反相色谱法）。
1.2.2 流动相注意事项 1.2.2.1 pH值的选择
C18和C8使用的流动相pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。
1.2.2.2 滤膜的使用
对于盐类等试剂，或者没有色谱纯的试剂，可以使用分析纯的，但是在使用前需要用0.45um或0.22um的滤膜过滤。盐类试剂最好现配现用。
使用滤膜时应注意：有机膜能滤水系，水系膜不能滤有机。如果流动相是有机溶剂的比例，那么就应该用有机膜过滤（但是如果是梯度进流动相的话，盐溶液可先单独用水膜过滤） 水膜：
纤维素微孔滤膜，易溶于丙酮等中等极性有机溶剂，不易燃烧，可用于空气测定之用，亦可用于乙醇或水液体过滤。 纤维素膜:
a) 醋酸纤维素膜：可过滤低分子量的醇类、水溶液、酒类、油类。 b) 硝酸纤维素膜：适用于水溶液、空气、油类、酒类过滤。不耐酸碱，溶于有机溶剂。可进行热压灭菌。
c) 醋酸纤维与硝酸纤维素混合酯膜：性质类硝酸纤维素膜。但可适用于PH值3～10范围，10％～20％的乙醇，50％的甘油，30％～50％的丙二醇等，而2％聚山梨酯80对膜有显著影响。
微孔滤膜使用前，应进行清洗处理，用蒸馏水浸泡洗净后装于滤器内，有机溶剂的过滤则用乙醇浸泡清洗。色谱样品或试剂的过滤，若是水系的，蒸馏水洗净浸泡后，再蒸馏水预过滤，若有机系过滤，最好先将本品在纯甲苯和95%以上的乙醇中分别浸泡过夜，再纯甲苯和纯乙醇预过滤，彻底洗净膜后使用。
微孔滤膜正反：
a) 各向同性，不分正反面，对额定孔径以上固体微粒能起到绝对截留的作用。
b) 有正反面，亮光强的为反面，亮光弱的为正面，膜内孔径从正面到反面逐渐递减。使用时应将正面对着待滤液，即待滤液从亮光弱的一面流入，滤净液从亮光强的一面流出，欲截留微粒相当于经历了孔径从大到小多层滤膜的阻截而不易堵塞，可显著延长使用寿命。使用时应在膜处理前认好正反面，（光线从侧面照膜可以比较出），作上记号，入水后正面将难以分辨。 有机膜尼龙（聚酰胺）微孔滤膜
材料为脂肪族尼龙，有良好的亲水性，耐适当浓度的酸碱，不仅适用于含有酸碱性的水溶液，亦适用于含有机溶剂，例醇类、烃类、醚类、酯类、酮类，苯和苯的同系物，二甲基甲酰胺，二甲基亚砜等等，是适用范围最广的微滤膜之一。有机膜入水后显著变脆，入有机溶剂强度的减少则轻些。有机能滤水系，水系不能滤有机。
1.2.2.3 有机相的选择
使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择，甲醇、乙腈和四氢呋喃。每一种溶剂都有其独特的优点，需根据具体情况选择。
有些样品的紫外吸收很弱，所以分析时紫外检测器的波长为220nm甚至更低，但是四氢呋喃的紫外吸收比较强，所以在波长低于240nm时，就不能选择这种溶剂。尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用，但是在低于220nm时，甲醇的浓度不易控制。
选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用，而四氢呋喃易分解，形成过氧化物，所以使用这种溶剂时须格外小心。一些研究人员发现，在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题，但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长，而且其不愉快的气味也是一个不利因素。与四氢呋喃相比，甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下，流速可控制在1-2ml/min之间。
考虑到理想溶剂的特点，如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用，而且使用方便，所以首选的有机溶剂应是乙腈，当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。
1.2.2.4 水相的选择
样品为一般化合物，可以用水作为水相，然而离子化合物在药
物分析时普遍存在，而这类化合物需要控制PH值才能得到很好的分离。如流动相的PH值必须高于或低于样品的PKA1.5个单位。在分析有机酸时，当PH值低于3时，色谱柱一般还比较稳定，然而当PH值高于8时，就需要缓冲液，因为此PH值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。宽PH值的二氧化硅柱也比较常见，但是对高PH值物质的分离，很少有这方面的报道。所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。
考虑到样品的特性及柱子的稳定，建议在分析PH值较高的物质时应使用缓冲液，2.5mM的磷酸盐缓冲液 (PH=2.5)是非常合适的水相。如果在分析方法中使用了分光仪，那么就必须选易挥发的缓冲液，
HPLC(液相色谱)常识及疑难详解(附实际操作图解)
