生物化学实验报告
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生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称 实验日期 合作者 评分
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血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量
实验地点 指导老师
批改日期
一、实验目的
1、1、学习醋酸纤维薄膜电泳的基本原理与操作方法; 1、2、了解电泳技术的一般原理;
1、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。
二、实验原理
2、1、血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7、4。它们在pH8、6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清
蛋白(Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
2、2、血清中不同蛋白质的等电点、分子量及含量
血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白的％ 清蛋白 4、64 69,000 57～72 α1－球蛋白 5、06 200,000 2～5 α2－球蛋白 5、06 300,000 4～9 β－球蛋白 5、12 90,000～150,000 6、5～12 γ－球蛋白 6、85～7、3 156,000～950,000 12～20 缓冲液pH=8、6,pI＜pH。
血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图
血清蛋白依次分为清蛋白,球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带
2、3、①膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比;③可将各色带剪开,分别溶于碱性溶液中;④用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。
三、材料与方法:
3、1、实验材料:
3、1、1、实验试剂:①样品:健康人血清(新鲜、无溶血);②巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8、6,离子强度0、06mol/L);③氨基黑10B染色液;④漂洗液;⑤洗脱液:0、4mol/NaOH溶液。
3、1、2、实验器材:①V-1100分光光度计(×1);②恒温水浴箱(×1);③试管(×6)、试管架(×1);④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜(2cm*8cm,厚度120μm);⑥培养皿(×5);⑦点样器或载玻片(×1);⑧平头镊子(×2);⑨剪刀(×1);⑩电泳槽(×1);?直流稳压电泳仪(×1) 3、2、实验步骤
1．准备与点样:①取2×8cm的膜条;②亚光面距一端1、5cm处取一点样线;③充分浸透在巴比妥缓冲液中;④取出膜条,用滤纸吸去多余的缓冲液;⑤点样器下端粘上薄层血清;⑥垂直点样。 点样示意图: 注意:点样线尽量点得细窄而均匀。 — 小组标记 样品标记 8cmm点样线 点样区 (粗面) + 2cm 2.电泳:①放置膜条(点样面向下,点样端置于阴极);②膜条贴紧滤纸,拉直膜条;③平衡五分钟;④通电(调节电压120v/电流,时间:45~60 min);③关闭电源。 1、电泳槽解剖图: 5cm 3、染色、漂洗:①通电完毕;②取出膜条;③浸于染色液(氨基黑10B)中,5min;④取
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