牛奶中三聚氰胺残留胶体金免疫层析快速检测方法研究
汤轶伟1, 2，焦雪晴1，崔芷萌1，陈金嫒1，任涛涛1，靳雨婷1，李希明3，励建荣*,1
【摘 要】为建立牛奶中三聚氰胺免疫层析快速检测方法，采用胶体金偶联特异性三聚氰胺抗体，优化试纸条T线抗原包被量、金标抗体用量、二抗稀释倍数等条件，构建三聚氰胺免疫层析试纸条. 结果表明， T线抗原包被量为0.25 μg/mL，金标抗体用量为9.0 μL/条，二抗稀释倍数为1:100时效果最佳；最优条件下该试纸条的最低检出限为0.25 μg/mL，结果可在5 min内进行判读，且牛奶样品不需任何处理可直接进行测定. 本研究建立的免疫检测方法适用于牛奶中三聚氰胺的检测.
【期刊名称】《渤海大学学报（自然科学版）》 【年(卷),期】2019(040)002 【总页数】6
【关键词】三聚氰胺；胶体金；试纸条；快速检测
【文献来源】https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_journal-bohai-university-natural-science-edition_thesis/0201273469100.html
基金项目：国家“十三五”科技支撑计划(2017YFF0211300).
0 引言
三聚氰胺俗称密胺、蛋白精，属于三嗪类含氮杂环有机化合物，化学名称为2, 4, 6-三氨基-1, 3, 5-三嗪，分子式为C3N6H6，氮含量约66%. 该化学品是生产三聚氰胺甲醛树脂的主要原料，在医学、轻工纺织、薄膜和轻工业等方向应用的比较广泛〔1-3〕 . 但由于三聚氰胺含氮量较高，致使一些不法商贩将其添
加到食品或动物饲料中，虚假提高蛋白质含量〔4〕. 动物实验表明，长期饲喂三聚氰胺可能造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部出现结石，并可进一步诱发膀胱癌〔5〕.
近年来，由于部分不良企业为牟取暴利非法操作、另加监管体系不够完善、缺乏有效的监管手段和检测技术等原因，使食品安全事件屡见不鲜. 所以，建立一种快速、准确检测食品中三聚氰胺残留的检测方法具有重要意义. 目前，检测三聚氰胺常用的仪器方法主要有高效液相色谱法〔6〕、电传感器法〔7〕、液相色谱-质谱/质谱法〔8〕等. 仪器分析法具有灵敏度高、检测限低、检测结果准确等优点，但是该方法对实验用的仪器要求比较高，需要相关的专业人员对操作者进行培训，样品的前期处理比较麻烦，不能满足现场快速检测的实验条件. 免疫分析法具有简便、快速、灵敏度高等特点，广泛应用于药物残留检测领域. 胶体金免疫层析法是一种传统的固相免疫标记技术，在食品领域被广泛应用〔9〕. 本文以三聚氰胺抗体作为基础，建立了一种对牛奶中残留的三聚氰胺进行快速检测的一种胶体金免疫层析法，为丰富牛奶中三聚氰胺残留快速检测方法提供技术支持.
1 材料与方法
1.1 试剂
三聚氰胺分析标准品(阿拉丁)；HRP-羊抗兔IgG、羊抗兔IgG(郑州益康生物工程有限公司)；氯金酸(百灵威)；牛血清白蛋白(Umbrella)；聚乙二醇20000(天津市光复精细化工研究所)；牛奶(市售). 1.2 主要仪器设备
硝酸纤维素膜、超纯水仪Milli-Q(Millipore Corporation)；玻璃纤维素膜
SB08、玻璃纤维素膜RB45、吸水纸、PC背板、单位平面点膜喷金仪(上海金标生物科技有限公司)；智能生化培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)；冷冻离心机(Thermo).
1.3 三聚氰胺抗体、包被原参照文献〔10〕制备 1.4 三聚氰胺免疫胶体金快速检测试纸条的研制 1.4.1 胶体金的合成 1.4.1.1 玻璃器皿的清洁
为保证实验结果的准确，将实验中可能会用到的玻璃器皿进行清洁处理. 首先用流动水将玻璃器皿上的灰尘等杂物进行冲洗，再将玻璃器皿放入重铬酸钾洗液中放置24 h，取出后用自来水洗净洗液，然后用蒸馏水进行多次冲洗，再用去离子水冲洗多次，将清洗过的玻璃器皿放置在60 ℃烘箱中进行烘干. 1.4.1.2 胶体金的制备
本实验合成胶体金的方法是经典的柠檬酸三钠还原法〔11〕. 具体操作如下：将100.0 mL 0.01%的氯金酸溶液加热到沸腾，之后向其中加入2.0 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，在溶液颜色开始发生变化，并且趋于稳定，在继续保持温度15 min，再在室温条件下持续搅拌，将温度降至室温，在4 ℃下保存备用. 1.4.2 胶体金标记抗体蛋白 1.4.2.1 抗体蛋白处理
为将多余的盐离子去除，将未标记的三聚氰胺抗体放置在透析袋中，在4 ℃低温条件下进行搅拌12 h.
1.4.2.2 胶体金标记抗体最佳pH的检测〔12〕
首先在1 mL的胶体金溶液中，用0.1 mol/L 碳酸钾溶液和0.1 mol/L 盐酸溶
牛奶中三聚氰胺残留胶体金免疫层析快速检测方法研究
