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野生干蕨菜对亚硝酸盐清除作用研究实验方案
2.实验方案 2.1.仪器
分光光度计、 电子天平、 粉碎机、 比色皿、 移液管、 烧杯、 棕色容量瓶、 三角瓶、 恒温水浴锅、 精密pH值试纸 2.2．试剂
对氨基苯磺酸、 盐酸萘乙二胺、 亚硝酸钠、 柠檬酸、 柠檬酸钠、 盐酸、 氨水均为分析纯, 蒸馏水。
对氨基苯磺酸溶液( 0.4 %) : 称取0.4g对氨基苯磺酸, 溶于100mL20%盐酸中, 置棕色瓶中混匀, 避光保存;
盐酸萘乙二胺溶液( 0.2 %) : 称取0.2g盐酸萘乙二胺, 溶解于100mL水中, 混匀后, 置棕色瓶中, 避光保存;
亚硝酸钠标准溶液: 准确称取0.1000g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠, 加水溶解移入500 mL容量瓶中, 加水稀释至刻度, 混匀。此溶液每毫升相当于200μg的亚硝酸钠;
亚硝酸钠标准使用液: 临用前, 吸取亚硝酸钠标准溶液5.00ml, 置于200ml容量瓶中, 加水稀释至刻度, 此溶液每毫升相当于5μg亚硝酸钠;
O.5mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液( pH=3.0) : 取0.1mol/L柠檬酸18.6ml( 21.01gm/l) , 0.1mol/L柠檬酸钠1.4ml( 29.41g/ml) 加蒸馏水定容至100ml。
盐酸( 0.1mol/l) : 量取5ml盐酸( 35%-37%) , 用水稀释至600ml。 25%氨水; 2.3.原料
野生干蕨菜。 2.4．实验方法 2.4．1. 样品的制备
将干蕨菜粉碎, 称取7份5g蕨菜粉, 分别加入7个三角瓶中, 各加入30ml
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蒸馏水, 在不同条件( 温度、 时间、 配比, pH值) 下提取, 然后用4000 r/min转速离心10 min, 取上清液备用。 2.4．2. 最大吸收波长的确定
准确吸取5μg/ml硝酸钠标准液7ml置于25ml容量瓶中, 加入0.4 %对氨基苯磺酸1.0mL, 摇匀, 静置4min, 加入0.5mL0.2 %盐酸萘乙二胺, 加水定容至刻度,摇匀, 静置15min。另以蒸馏水代替亚硝酸钠, 用同样配制方法的溶液作为空白( 即参比溶液) , 做光谱扫描, 测定最大吸收波长。 2.4．3. 标准曲线的绘制
分别吸取0.00、 1.00、 2.00、 3.00、 4.00、 5.00、 6.00、 7.00mL亚硝酸钠标准使用液分别置于25ml容量瓶中, 加入0.4 %对氨基苯磺酸1.0mL, 摇匀,静置4min, 加入0.5mL0.2 %盐酸萘乙二胺, 加蒸馏水定容至刻度,摇匀, 静置15min于最大波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标绘制标准曲线, 另以蒸馏水代替亚硝酸钠, 用同样配制方法的溶液作为空白( 即参比溶液) 。( R=0.999)
2.4．4 .样品提取液对亚硝酸盐的清除能力的测定
准确吸取5μg/mL NaNO27mL, 置于25mL容量瓶中, 加入5mL蕨菜提取液, 反应10min, 然后加入0.4%对氨基苯磺酸1mL, 摇匀, 静置4min,再加入0.2%盐酸萘乙二胺0.5mL, 摇匀加水定容至25mL, 静置15min, 用2cm 比色皿于最大吸收波长处测定吸光度A1; 以蒸馏水代替提取液做空白, 测得吸光度A2。按下式计算蕨菜提取液对亚硝酸盐的清除率。
清除率( %) =( A2-A1) /A2×100% A1—加蕨菜汁提取液测得值; A2—未加蕨菜汁提取液测得值。
2.4．5. 浸提温度对清除亚硝酸盐的影响试验
取在不同温度( 20℃、 30℃、 40℃、 50℃、 60℃、 70℃、 80℃) 水浴下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中, 均加入5μg/mlNaNO27ml, 在室温下反应10min, 均加入对氨基苯磺酸, 盐酸萘乙二胺定容、 显色, 测得在最大吸收波长
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处的吸光值, 试验重复三次, 计算清除率。
表1不同提取温度对亚硝酸盐的清除率
温度( ℃)
A1(n=3)
A2(n=3)
清除率( %)
20( 室温)
30 40 50 60 70 80
2.4．6 .蕨菜汁提取液与亚硝酸盐提取时间试验
取在不同提取时间( 0min、 30min、 60min、 90min、 120min、 150min、 180min) 下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中, 均加入5μg/mlNaNO27ml, 在室温下反应10min, 均加入对氨基苯磺酸, 盐酸萘乙二胺定容、 显色, 测得在最大吸收波长处的吸光值, 试验重复三次, 计算清除率。
表2不同提取时间对亚硝酸盐的清除率
时间( min)
A1(n=3)
A2(n=3)
清除率( %)
0 30 60 90 120 150 180
2.4．7. 蕨菜汁用量对亚硝酸盐清除率的影响试验
取在不同提取配比下的提取液( 0ml、 1ml、 2ml、 3ml、 4ml、 5ml、 6ml) 7份5mL于7个25mL容量瓶中, 均加入5μg/mlNaNO27ml, 在室温下反应10min, 均加入对氨基苯磺酸, 盐酸萘乙二胺定容、 显色, 测得在最大吸收波长处的吸光值, 试验重复三次, 计算清除率。
表3不同提取用量对亚硝酸盐的清除率
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用量( ml) A1(n=3) A2(n=3) 清除率( %)
0 1 2 3 4 5 6
2.4．8.不同pH值对亚硝酸盐清除试验
取在不同提取pH值( 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7) 下提取液7份5mL于7个25mL容量瓶中, 均加入5μg/mlNaNO27ml, 在室温下反应10min, 均加入对氨基苯磺酸, 盐酸萘乙二胺定容、 显色, 测得在最大吸收波长处的吸光值, 试验重复三次, 计算清除率。
表4不同提取pH对亚硝酸盐的清除率
pH
A1(n=3) A2(n=3) 清除率( %)
1 2 3 4 5 6 7
2.4.9.最佳清除条
以提取温度、 提取时间、 提取液用量、 提取PH值,做L9( 34) 正交试验, 确定最佳清除条件。
表5 L9(34)正交试验结果分析
试验号
1 2 3 4
A
1 1 1 2
B
1 2 3 1
C
1 2 3 2
D
1 2 3 3
清除率%
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5 6 7 8 9 K1 K2 K3
2 2 3 3 3
2 3 1 2 3
3 1 3 1 2
1 2 2 3 1
K1 K2 K3
R
2.5.模拟胃液条件下亚硝酸盐NaNO2消除反应
取O.5mol／L柠檬酸钠-HC1缓冲液(pH=3) 5.0ml, 准确吸取5μg/ml硝酸钠标准液7ml置于25ml容量瓶中, 加入0.4 %对氨基苯磺酸1.0mL, 摇匀静置4min, 加入0.5mL 0.2 %盐酸萘乙二胺, 加水定容至刻度,摇匀, 静置90min, 测吸光度值, 试验重复三次。
野生干蕨菜对亚硝酸盐清除作用研究实验方案样本
