MALDI-TOF MS技术在病原菌检测与鉴定中的应用研究
王海花1 ， 张晓峰1 ， 苗 丽2 【期刊名称】中国兽医杂志 【年(卷),期】2017(053)002 【总页数】5
病原微生物引起的动物疾病不仅严重影响到动物的经济价值也威胁着人类健康， 随着近年来抗菌药物的滥用导致多种细菌耐药以及部分新型细菌的出现使形势更加严峻。传统的微生物鉴定方法主要有表型的检测，包括革兰染色、微生物分离培养和生化试验等，因时间较长、鉴定范围窄，影响了病原微生物鉴定的速度和准确性，在一定程度上影响了疾病的控制。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的应用于微生物快速检测的一项技术。基于绘制微生物的蛋白质指纹图谱与已知标准微生物的蛋白指纹图谱数据库进行比较达到鉴定的目的。不同的细菌经MALDI-TOF MS检测可以形成特异性的指纹图谱，建立这些细菌的图谱库，将待测细菌的质谱图与已有质谱图库进行比较，即可确定细菌种属。由于所得到的蛋白质图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度、表达稳定且进化保守的核糖体蛋白，因此其鉴定结果稳定、可靠。
1 MALDI-TOF-MS技术的原理
将微生物样品和基质溶液以一定比例混合，取数微升上述混合溶液点在靶板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶体，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质从激光中获取能量跃迁成为激发态使样品发生解析离子化，离子在电场作
用下加速飞过飞行管道，飞行时间与离子的质荷比(m/z)成正比，分子量较小的分子，飞行的较快，以离子质荷比(m/z)为横坐标，离子峰强度为纵坐标，形成质量图谱，将质量图谱与已知质谱图数据库中的特征性质谱图比对，筛选并确定出特异性图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。
2 MALDI-TOF-MS在食源性致病菌检测中的应用
根据国家食源性致病菌监测要求,微生物检测项目主要是沙门菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、弯曲菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌等。目前对食源性致病菌的病原学检测依赖细菌的生化代谢和血清学反应结果来判定，耗时较长。基于基因型鉴定方法，细菌核糖体基因序列分析、荧光定量PCR检测特定的基因等易出现假阳性结果的想象，而MALDI-TOF-MS方法从首次报道用于微生物的鉴定以来，一直被许多国内外研究学者应用，收到很好的效果。
战晓微等[1]从牛肉骨粉中分离出甲型副伤寒沙门菌的野生分离株，用传统方法与MALDI-TOF-MS方法进行检测比较，MALDI-TOF-MS检测的可信度分值为2.372，检测结果与传统方法一致且准确性较高。Karen L等[2]用MALDI-TOF MS方法对致泻性大肠埃希菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌、肠炎耶尔森菌等31株常见食源性致病菌进行成功鉴定，进一步验证了该技术在微生物鉴定方面的可靠性。Barbuddhe S B[3]等应用Maldi-TOF MS方法测试了不同血清型的李斯特菌，不同血清型李斯特菌的特征性峰值不同。该方法与PFGE对不同血清型的李斯特菌比较，表明MALDI-TOF MS可以有效鉴别李斯特菌及其亚型，甚至可以鉴定到种水平。通过对单增李斯特菌标准菌株进行验证，表明鉴定结果的可信度很高。R.Dieckmann等[4]对12个属456致病菌
株成功进行了鉴定。资料显示，有很多研究学者采用MALDI-TOF MS方法在宋内志贺菌、克罗诺杆菌、大肠埃希菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、沙门菌等食源性致病菌的快速检测方面进行应用，效果良好。 龚艳清等[5]从冷冻保存的罗非鱼、鳗鱼、大菱鲆、鲤鱼、牛蛙及甲鱼等水生动物中分离的20 株迟缓爱德华菌用MALDI-TOF MS和全自动微生物鉴定仪VITEK方法进行鉴定比较，结果表明，MALDI-TOF-MS方法检测的20株迟缓爱德华菌与数据库中的质谱图匹配比较，分值均在2.35以上，准确性较高。而全自动微生物鉴定仪VITEK检测的迟缓爱德华菌的鉴定值只有85%，说明MALDI-TOF MS方法在重复性、稳定性、准确性等方面总体优于传统生化鉴定方法。战晓微等[6]分别从养殖生猪、动物源性食品以及从食物中毒患者及食品加工人员中分离的47株大肠杆菌分离株，经MALDI-TOF MS方法检测收集菌株的蛋白指纹图谱与数据库中的质谱数据比对分析，结果表明，该47株菌株均为大肠杆菌且可信度分值分布于1.9～2.5之间，与常规方法分离大肠杆菌的鉴定结果一致。可信度分值的差异说明该47株大肠杆菌存在显著差异。 Wang Y等[7]从样品中分离的37株单增李斯特菌，应用MALDI—TOF MS方法采集蛋白质指纹图谱，汇集成单增李斯特菌图谱数据库与标准菌进行验证，并在此基础上对37株单增李斯特菌分离株进行聚类分析，结果表明,MALDI-TOF MS方法将37株单增李斯特菌分离株分成9个型，以此建立了MALDI-TOF MS快速鉴定与分型方法。Bao C M[8]等分别使用直接涂抹法和提取法处理，对200株宋内志贺菌野生株及致泻性大肠埃菌进行鉴定验证，结果表明，宋内志贺菌经涂抹法鉴定准确率为71.5%，而经提取法鉴定准确率为100%，并以此建立了鉴定宋内志贺菌的质谱数据库，通过对比分析宋内志贺菌的离子
MALDI-TOF MS技术在病原菌检测与鉴定中的应用研究
