通用SYBR Green qPCR实验方案
技术槪述：SYBR GREEN QPCR
随着具有荧光检测功能的热循环仪的发展，PCR具有了新的创新应用。在常规PCR中，关键结果是在该过程后产生的最终扩增子数量。实时或定量PCR和RT-PCR利用DNA扩增的线性原理，确定样品中已知序列的绝对或相对量。通过在反应中使用荧光报告基团，可以测量DNA产量。
图 1.技术槪述：SYBR Green qPCR
在定量PCR中，会监测每个PCR循环中的DNA扩增。当DNA处于对数线性扩增阶段时，荧光量相对于背景增加。荧光变得可测的那一点称为定量循环（Cq）或交叉点。通过多次稀释已知量的标准DNA，可以产生Cq的对数浓度标准曲线。然后可以根据Cq值计算未知样品中DNA或cDNA的量。 A) 反应的不同阶段：
基线：模板初始浓度低，因此荧光强度太低而不能被检测到，只有背景信号明显存在。
指数：在靶样产量达到检测阈值（显示为红色阈值线）后，可在整个指数阶段可以跟踪反应过程。 线性：随着模板浓度的增加，可用的DNA聚合酶浓度下降，反应速率降低。
高原：没有足够的游离酶继续扩增，因此在这个点之后，反应处于最大产量期，也就是平台期。
B) 个体反应的特征在于荧光首先升高到阈值以上的循环，其被称为定量循环 (Cq)。如果起始材料丰富，则会在较早的循环中观察到扩增，这种情况中Cq较低。如果起始材料稀缺，则在后续循环中观察到扩增，Cq较高。荧光、Cq和扩增产物的量之间的这种相关性，使得我们能够在宽动态范围内定量模板。
实时PCR也适用于相关研究。可以使用对每个待扩增区域独特的引物进行反应，并用不同的荧光染料标记。几种市售的定量热循环仪包括多个检测通道。在该多重系统中，可以将靶DNA / cDNA的量与管家序列（例如GAPDH或β-肌动蛋白）的量进行比较。
SYBR Green qPCR应用 质量筛选 XX
芯片验证 XX
多个靶基因/少量样品 X
SNP检测 NR
等位基因鉴别 NR
病原体检测 X
多重测定（Multiplexing） NR
病毒含量定量 NR
基因表达分析 X
基因拷贝测定 NR
终点基因分型 NR
体外定量 NR
NR= 不推荐
X= 推荐 XX= 首选方法
测定方案考虑因素
DNA制备
确保PCR成功最重要的一步是高质量的DNA制备。DNA模板的完整性和纯度至关重要。定量PCR涉及多轮酶促反应，因此对蛋白质、苯酚/氯仿、盐、EDTA和其他化学溶剂等杂质更加敏感。污染物也会干扰荧光检测。260nm和280nm处的吸光度值的比率给出了DNA纯度的估计值。纯DNA的A260 / A280比率为1.8-2.0，较低的比率表明存在诸如蛋白质的污染物。 模板
启动qPCR需要非常少的靶核酸变性（相当于约100 pg的gDNA或cDNA）。为最大限度减少反应抑制剂的污染，应将起始模板量保持在实现精确定量所需的最小值。当起始材料是RNA时，引物设计和DNase I处理将减少可能由gDNA污染产生的信号。 引物设计
无论是使用dsDNA结合染料还是基于探针的检测化学，设计高质量引物都是qPCR中最关键的实验前步骤之一。应使用引物设计软件来设计PCR特异性引物，以消除引物二聚体和二级结构引入的复杂问题。引物浓度过低会降低引物二聚体形成和非特异性产物积累，在定量PCR中使用SYBR Green I染料时这一点尤为重要。 dNTP
标准PCR / qPCR预混液含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP。然而，有些可用的混合物用dUTP代替了dTTP。使用dUTP进行的先前反应的产物将含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。所以它们易受尿嘧啶-DNA-糖基化酶（UNG）切割。因此，事先用UNG孵育后续反应物可防止反应之间的携带污染物。为确保高效，实验室中的所有反应都必须使用dUTP。 镁浓度
氯化镁 (MgCl2) 是逆转录酶、Taq DNA聚合酶和Taq DNA 5'至3'核酸外切酶活性必需成分。含有DLP的反应物的最佳Mg2+浓度通常在3 - 6 mM之间。氯化镁浓度越低，通常形成非特异性产物越少。某些ReadyMix溶液以2X浓度的7 mM氯化镁（终浓度为3.5 mM）提供。在某些情况下，如果需要，可提
供一小瓶25 mM氯化镁溶液以进一步优化最终的氯化镁浓度。有时可能需要不含MgCl2的反应混合物，从而可以使用更低的反应浓度——例如使用Scorpion探针检测时。 逆转录酶
提供高产量cDNA、同时在高温下保持活性的逆转录酶对RT-qPCR的成功至关重要。其在高温下的高效酶性能有助于去除具有显著二级结构的RNA区域的稳定性，从而易于杂交和随后扩增。当进行一步法RT-qPCR时，高温性能允许使用具有高解链温度(Tm)的基因特异性引物，增加了反应特异性。当进行两步法方案时，重要的是确保酶能够使来自RNA的cDNA具有线性、成比例的产率。尽量减少移液步骤可以减少差异性。一些ReadyMix包含进行RT所需的引物和其他试剂，例如ReadyScript? cDNA合成混合物（RDRT）。 Taq DNA聚合酶
就像RT需要选择最合适的逆转录酶一样，适当的DNA聚合酶选择至关重要。天然Taq DNA聚合酶的一个基本问题是酶在低温下具有残余活性。这种残留的聚合酶活性会导致非特异性引物结合，进而形成非特异性产物。抗体阻断或化学阻断的Taq DNA聚合酶（“热启动”）有助于通过阻止酶活性来纠正这种情况，直到高温变性步骤开始。请参阅《PCR混合液选择指南》确定适合您应用的最佳热启动聚合酶。
按仪器类型选择内参染料
一些实时PCR热循环仪需要ROX等上样染料来控制光学系统的可变性，并标准化信号强度的差异。同样地，一些热循环仪在使用SYBR Green I染料（具有非常低的背景）检测试剂盒时，需要荧光素来产生虚拟背景。这些组分可以在ReadyMix中提供，也可作为单独的组分提供，因此可选用适当的浓度。在某些情况下，会包括一小瓶用于反应标准化的内参染料。该染料的最大激发波长为586nm，最大发射波长为605nm。ROX参比染料的标准仪器设置非常适合内参染料测量。这种内参染料是ABI序列检测系统所必需的。 仪器
需要选择与仪器兼容的试剂。平台可使用不同的标准化染料，因此需要选择具有相容标准化染料的试剂（请参见附录1）。
许多qPCR仪器设计用于支持特定范围的应用，例如，ABI 7900支持高通量、384孔板自动上样，而Illumina Eco支持单个48孔板应用。最合适的仪器需要满足研究要求。理想的做法是选择具有用户友好软件的仪器，既可执行最想要的功能，又具有灵活的数据输出方式，以便下游统计分析软件程序包处理数据。这可减少培训人员所需的时间，可获得优异的分析结果。所需的其他功能包括一个绝对一致的
PCR模块（96个重复孔的最大绝对偏差为1Cq = 2倍），以及一个光学系统，可以在很宽的波长范围内灵敏、均匀地激发和检测发射光。此设计允许广泛地选择荧光团，实现多重检测。另外还要考虑的其他特性是特定耗材相关的运作成本，例如，如果在反应中不使用标准微量滴定板，就需要考虑非标准型上样板或管的方便性。 对照
阳性对照始终有助于确保所有的试剂盒组分正常工作。无模板 / 阴性对照可确定是否存在污染。无模板对照信号表明存在DNA污染或引物二聚体形成。 缓冲液
缓冲液或反应混合物通常含有dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCl2和稳定剂。根据检测化学试剂、仪器和反应要求，可能还需要SYBR Green I、ROX?、荧光素和惰性上样染料。PCR缓冲液组分和稳定剂通常是制造商专有的。由于每种成分都可以在反应中单独优化，如果单独购买，可最大限度提高灵活性。虽然所有组分混在一起的预混液用起来不太灵活，但它提高了批次的一致性和便利性，同时减少了移液步骤，从而减少错误和污染的可能性。 数据分析
建议使用推荐的实时仪器进行定量SYBR Green PCR。以下内容可能对仪器新用户有帮助。通常会绘制循环数与荧光的关系图。可通过循环阈值 (CTs)或交叉点确定每个样品中的模板量。循环阈值或交叉点是能够检测到PCR产物形成而导致荧光增加的第一个循环。交叉点之前的循环是基线循环。基线循环是指由于PCR产物的存在而引起荧光增加，但尚未达到可检测水平的循环。用于确定何时发生第一次可检测荧光增加的阈值也可以手动调节。必须在对数扩增图上绘出阈值。在对数扩增图中，阈值应设置在对数线性范围内，而不是高原阶段。 解链曲线
在运行结束时进行解链曲线分析将有助于仅分析目标PCR产物。按照实时仪器制造商的说明进行解链曲线分析。通过在另外的循环步骤中收集数据，可以修改使用相同引物的连续反应，以去除引物二聚体形成对产物信号的影响——但这一循环温度必须介于已经确定的二聚体和产物解链温度（TM）之间。
定量方法
标准曲线
标准曲线对于绝对和相对定量都是必需的。当生成标准曲线时，应使用不同浓度的DNA（通常为5个）来生成标准曲线，该曲线将包含未知样品的浓度。每种浓度应一式两份。 绝对和相对定量
此SYBR Green PCR试剂盒可用于绝对或相对定量靶标DNA。绝对定量技术用于确定初始样品中靶标DNA量，而相对定量则确定靶标DNA量与参照扩增子之间的比率。理想的参照扩增子将具有不变的组成型表达。在实践中，可针对此功能选择管家基因，但还有其他参考选择更好地符合上述要求。1 绝对定量使用外部标准品来确定目标靶核酸的绝对量。为了消除退火引起的定量差异，外部标准品的引物结合位点必须与靶标序列中的引物结合位点相同。理想的外部标准品序列与靶标序列相同或仅稍微不同。对于绝对定量，靶标与外部标准品之间的扩增效率必须相当。一旦确定出合适的构建体或扩增子，既可绘制外部标准稀释液的标准曲线，确定未知靶标浓度。
相对定量允许计算样品中靶标模板和参照模板之间的数量比。由于该方法测量靶样相对于假定不变的对照品的数量，因此相对qPCR最常用于测量遗传多态性差异，例如，组织之间或健康与疾病样品之间的差异。该技术的优点是使用内部标准可以最大程度地减小样品制备和处理中的差异。使用SYBR系统时，必须通过单独的反应运行靶标和内参定量。
相对定量的准确性取决于标准品中参照模板的适当选择。标准品的差异性将影响结果，因此必须确保标准品适当。1一些研究人员选择不运行标准曲线，并以参照品的分数形式报告靶标数量，这种技术称为比较定量。另外，我们还可以假设靶标和参照的扩增效率可以忽略不计，而只基于参照序列确定的标准曲线定量靶标。最后，在最准确的相对定量技术中，需要测量参照和靶标的扩增效率，并确定校正因子。该过程称为标准化，1 需要含有已知浓度的靶标及参照，并且需要生成两条标准曲线。 PCR反应效率测定
通过为每个靶标制备连续稀释液，来确定参照与靶标之间的PCR效率。从靶样中减去参照样的CT值，并将这个CT值的差相对于模板量的对数作图。如果得到的直线斜率小于±0.1，则判断扩增效率相似。
设备
? ? ?
定量PCR仪器 微量离心机
PCR设置的层流罩（选购件）
耗材
? ?
qPCR SYBR Green混合液 — 请参阅qPCR选择指南（第1部分和第2部分）
DNA / cDNA模板 — cDNA反应，以1:10稀释，用于检测中等至高度表达的靶样，或以1:2至1:5稀释，用于罕见转录或或10 ng至100 ng gDNA
正向和逆向引物，稀释至工作浓度（10 μM工作原液足以进行大多数检测）
o o
?
在此订购定制的寡核苷酸
预先设计的基因表达引物也适用于大多数模型生物 (KiCqStart? SYBR? Green Primers, KSPQ12012)
? 无菌过滤器移液管吸头
? ?
无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管（例如CLS430909） PCR管，选择匹配所需形式的试管：
o o
单个薄壁200 μL PCR管（Z374873或P3114） 平板
? ?
96孔板（Z374903） 384孔板（Z374911）
ThermalSeal RTS? 密封膜（Z734438） ThermalSeal RT2RR? 薄膜（Z722553）
o
封板膜
? ?
?
PCR级纯水（W1754）
SYBR GREEN PCR 混合液选择指南 — 第1部分 SYBR GREEN PCR 混合液选择指南 — 第2部分
含热启动酶和单独组分的ReadyMix 单独供应的参比染料 单独提供的MgCl2 单独供应的参比染料
兼容仪器：
请参阅附录1查找仪器的最佳参比染料浓度
SYBR? Green JumpStart? Taq ReadyMix? (S4438)
LuminoCt?SYBR?Green qPCR ReadyMix? (L6544)
SYBR? Green JumpStart? Taq ReadyMix? (S5193)
实验方案
准备
1. 将所有反应组分置于冰上。
2. 混合，然后短暂离心以收集管底部的内容物。 标准SYBR Green I染料反应
说明：我们观察到，当使用比常规PCR更高的引物浓度时，在KiCqStart ReadyMix中运行的测定是最佳的。在下面的实验方案中，我们使用450nM终浓度，观察到是几种独立实验的最佳浓度。
1.准备足够的预混液，以一式两份运行所有样品。 a. 请务必包含一式两份无模板阴性对照样（NTC）。 b. 根据所选的qPCR试剂选择下面的相应表格。
c. 计算要混合的试剂量。增加10％的体积，以防移液错误时备用 d. 混合均匀，避免气泡。 KiCqStart试剂的预混液： 反应 目标终浓度 每单份20 μL 反应物的体积 (μL) 2X qPCR混合液
1X
10 μL
正向引物（10 μM原液）
0.45 μM
0.9 μL
逆向引物（10 μM原液）
0.45 μM
0.9 μL
PCR级纯水
其他完全qPCR ReadyMix的预混液 : 反应 目标终浓度 每单份20 μL 反应物的体积 (μL) -
3.2 μL
2X qPCR混合液
1X
10 μL
正向引物（10 μM原液）
0.2 μM
0.4 μL
逆向引物（10 μM原液）
0.2 μM
0.4 μL
PCR级纯水
qPCR试剂与单独组分的预混液： 反应 -
4.2 μL
目标终浓度 每单份20 μL 反应物的体积 (μL) 2X qPCR混合液
1X
10 μL
正向引物（10 μM原液）
0.2 μM
0.4 μL
逆向引物（10 μM原液）
0.2 μM
0.4 μL
25mM MgCl2（如果单独提供）
3.5mM
3.5 μL1
参比染料（如果单独提供）
0至0.25 μL2
PCR级纯水
12
4.2 μL
最佳MgCl2浓度可以为1 mM至6 mM。 请参阅附录1查找仪器的最佳参比染料浓度。
2.设置反应：
a. 对于NTC反应，向反应管中添加4 μL水。 b. 对于实验反应，向反应管添加4 μL cDNA溶液。
c. 短暂离心所有试管。目测确认所有试管或孔在底部都含有正确体积的样品。 d. 小心地将16 μL模板预混液等分到每个qPCR管或板孔中。 e. 充分混合反应物并视需要离心。
f. 给试管盖上盖子，或密封好板子，并贴上标签（根据仪器要求）。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。）
3.根据仪器制造商的建议运行样品。下面将给出标准和快速循环的例子。
标准循环参数： 温度 时间 初始变性
94 °C 2 min
40 个循环：
变性
94 °C 15 s
退火、延伸、 以及读取荧光
60 °C或比最低 引物 TM低5 °C
1 min
（任选）保温
4 °C，仅限产品 在凝胶上运行时
快速循环参数： 温度 (oC) 时间 (s) 初始变性 95 30
40 个循环：
第1步 95 5
第2步 58 15
第3步 72 10
说明：使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。
4.有关如何分析数据的指南，请参阅仪器手册。
附录1
推荐用于仪器的参比染料浓度。对于参比染料单独供应的qPCR试剂 仪器 参比染料的终浓度 参比染料的μL体积 （每20 μL反应物） Applied Biosystems 5700 1X 0.2μL
Applied Biosystems 7000
1X
0.2μL
Applied Biosystems 7300 1X 0.2μL
Applied Biosystems 7500 0.1X 0.02μL
Applied Biosystems 7500 Fast 0.1X 0.02μL
Applied Biosystems 7700 1X 0.2μL
Applied Biosystems 7900 1X 0.2μL
Applied Biosystems 7900 HT Fast 1X 0.2μL
Applied Biosystems 7900HT 1X 0.2μL
Applied Biosystems StepOnePlus? 1X 0.2μL
Applied Biosystems StepOne? 1X 0.2μL
Applied Biosystems ViiA 7 0.1X 0.2μL
Bibby Scientific Techne? Prime Pro 48 未使用 -
Bibby Scientific PCRmax? Eco 48 未使用 -
Bio-Rad CFX384?
未使用
-
Bio-Rad CFX96?
未使用
-
Bio-Rad MiniOpticon?
未使用
-
Bio-Rad/MJ Chromo4?
未使用
-
Bio-Rad/MJ Opticon 2
未使用
-
Bio-Rad/MJ Opticon?
未使用
-
Cepheid SmartCycler?
未使用
-
Eppendorf Mastercycler? ep realplex
未使用
-
Eppendorf Mastercycler? ep realplex2 s
未使用
-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? 3000
未使用
-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? 6000
未使用
-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene? Q
未使用
-
Roche LightCycler? 480
未使用
-
Stratagene Mx3000P? 0.1X 0.02μL
Stratagene Mx3005P? 0.1X 0.02μL
Stratagene Mx4000? 0.1X 0.02μL
故障排除指南
问题 可能原因 解决方案 未观察到PCR产物。
PCR组分缺失或降解。
务必运行阳性对照以确保组分功能正常。还建议在组合各个反应时使用核查表。
SYBR降解。 运行琼脂糖凝胶，以分析反应产物。如果有适当尺寸的单个条带明显可见，则检测有误。SBYR Green I对光线敏感，必须加以保护。
退火温度太高。 以2-4°C的增量降低退火温度。
模板质量差。 通过琼脂糖凝胶电泳评估模板完整性。可能需要使用能最小化剪切和切口的方法来重新纯化模板。由于提取或纯化失败，可能没有模板。
引物的设计不理想。
通过在已知模板上运行连续稀释来检查引物组。根据需要重新订购或设计。
初始变性温度持续时间太长。
省却激活步骤。JumpStart Taq可能会在较长（> 3分钟）的初始变性时间内降解。
靶模板很复杂。 在大多数情况下，靶样的固有复杂性是由于异常高的GC含量和/或二级结构造成的。据报道，在0.8-1.3 M的浓度下，甜菜碱有助于扩增高GC含量的模板。2
参比染料不匹配。 对于Rn（标准化荧光）图，关闭参比染料。也可查看qPCR扩增曲线的原始荧光。去除标准化
通常会将图恢复到预期的形状，从而能够计算更合理的Ct值。也可在反应物中滴定参比染料。查看最后故障排除部分的建议。
执行的循环太少。 增加循环数。
模板不够多。 增加循环次数后无效，则用10倍浓度的模板重新反应。
PCR产物过长。 当PCR产物在100-150 bp之间且不超过800 bp时结果最好。
Mg22+ 浓度不理想。
最佳氯化镁浓度随测定的不同而不同，范围从1.5至5 mM不等。使用25 mM MgCl2（M8787）在该范围内进行氯化镁滴定。
未激活检测，或者在错误的步骤中激活了检测。
确认为正确检测启动了采集模式。SYBR Green检测的采集模式为“单一”，并且是在延伸步骤或者任选检测步骤中收集。
引物降解。 检查聚丙烯酰胺凝胶上的引物降解情况。
选择的染料层错误。
确保在序列检测软件的设置视图中激活了正在使用的报告基团。
Y轴上的值不正确 更改y轴上的值。双击ΔRn 即可更改y轴的值。
PCR效率太低（<80％）
退火温度太低。 以2-3°C的增量提高退火温度。
模板包含抑制剂。 运行标准曲线（log [DNA] 与 Cq的关系曲线）。如果曲线在高DNA / cDNA浓度时是非线性的，则修改DNA / cDNA纯化，或将模板浓度限制在线性范围内。
引物设计不理想。 运行解链曲线或琼脂糖凝胶，以检查是否存在多个扩增子。
模板质量差。 通过琼脂糖凝胶电泳评估模板完整性。可能需要使用能最小化剪切和切口的方法来重新纯化模板。
初始变性温度持续时间太长。
省却激活步骤。抗体热启动Taq可能会在较长（> 3分钟）的初始变性时间内降解。
多个基因位点与引物组杂交。
运行解链曲线或琼脂糖凝胶，以检查是否存在多个扩增子。也可针对已测序的靶基因组，用NCBI程序e-PCR寻找多个扩增子。
移液错误导致结果差异。
制备大量的完全混合物，并将其等分为单独的反应物。如果差异仍然存在，请参阅下文。
仪器所用的参比染料或浓度有误。
请参阅附录1查找针对仪器推荐的参比染料浓度。
参比染料不匹配。 对于Rn（标准化荧光）图，关闭参比染料。也可查看qPCR扩增曲线的原始荧光。去除标准化
通常会将图恢复到预期的形状，从而能够计算更合理的Ct值。如果需要标准化，则必须通过滴定确定参比染料的最佳量。
信号与模板稀释度无关（有多种产物或产物模糊）。
退火温度太低。 以2-3°C的增量提高退火温度。
引物设计不理想。 确认序列信息的准确性。如果引物长度小于27个核苷酸，则尝试加长引物至27-33个核苷酸。如果引物的GC含量低于45％，尝试重新设计GC含量为45-60％的引物。
模板浓度太高。 降低PCR反应中的模板浓度。
引物浓度太高。 连续两倍稀释（例如0.1 μM，0.05 μM，0.025μM和0.0125 μM）降低引物浓度，并将这些试验反应物进行PCR。
PCR效率太高。
多个基因位点与引物组杂交。
运行解链曲线或琼脂糖凝胶，以检查是否存在多个扩增子。也可针对已测序的靶基因组，用NCBI程序e-PCR寻找多个扩增子。
技术重复返回的Ct值差异很大，或者数据给出无法解释的扩增曲线。
移液错误导致结果差异。
制备大量的完全混合物，并将其等分为单独的反应物。如果差异仍然存在，请参阅下文。
仪器所用的参比染料或浓度有误。
请参阅附录1查找针对仪器推荐的参比染料浓度。
样本和/或重复内部差异太大。
反应物混合不均匀。
轻轻涡旋和离心反应物。
板孔未盖紧或盖严。
盖紧或盖严所有板孔，甚至包括空板孔。未盖紧的板孔会影响相邻板孔的密封。
初始变性时间太长。
缩短初始变性进间至不超过两分钟。
多种PCR产物
引物设计不理想。 确认序列信息的准确性，以及引物序列对非靶序列的特异性。增加引物的长度，使它们更具靶向特异性。
引物降解。 检查聚丙烯酰胺凝胶上的引物降解情况。
Mg22+ 浓度不理想。
最佳氯化镁浓度随测定的不同而不同，范围从1.5至5 mM不等。使用25 mM MgCl2（M8787）在该范围内进行氯化镁滴定。
退火温度太低。 以2-3°C的增量提高退火温度。
DNA污染 检查所有试剂是否存在污染，并在层流罩中设置反应，以防来自其他反应的污染。
引物二聚体被扩增。
在循环程序中包括任选检测步骤，以避免检出引物二聚体。
模板浓度太高。 降低PCR反应中的模板浓度。
引物浓度太高。 连续两倍稀释（例如0.1 μM，0.05 μM，0.025μM和0.0125 μM）降低引物浓度，并将这些试验反应物进行PCR。
交叉点值的线性部分不对应于模板量的对数扩增部分。
模板量太高。 请勿超过模板DNA的最大推荐量。
模板量太低。 提高DNA的数量。
DNA污染 检查所有试剂是否有污染，并在层流罩中设置反应，以防交叉污染。
引物二聚体被扩增。
在循环程序中包括任选检测步骤，以避免检出引物二聚体。
未检测到荧光，或者荧光不定。
SYBR Green
ReadyMix未充分混合。
使用前彻底混合ReadyMix，以确保SYBR Green以适当浓度添加到所有毛细管中。
定量PCR仪器受到污染。
根据制造商的说明对仪器进行消毒。
扩增曲线达到最大值，然后在高模板量时降低。
减少用于基线计算的循环数。基线校正过度补偿并使信号变负。
暴露时间不当。 如果使用盖子（25）或光学粘胶盖（10），适当改变暴露时间。
材料
货号 产品描述
康宁公司?带螺旋盖微量离心管1.5 mL microcentrifuge tube, polypropylene, w/ attached
CLS430909screw cap, w/ 0-ring, sterile, natural, 500/cs
KCQS02KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?with ROX? for ABI instruments
KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?Low ROX?, for ABI and Stratagene instruments
KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?For Bio-Rad, Cepheid, Eppendorf, Illumina, Corbett, and Roche systems
KCQS01
KCQS00
KCQS03KiCqStart? SYBR? Green qPCR ReadyMix?iQ?, with fluorescein for Bio-Rad systems
L6669LuminoCt? qPCR ReadyMix?For fast probe-based quantitative PCR
L6544LuminoCt? SYBR? Green qPCR ReadyMix?For fast SYBR Green quantitative PCR
M8787氯化镁 溶液PCR Reagent, 25 mM MgCI2 solution for PCR
Z374873带盖PCR微管capacity 0.2 mL
Z374903PCR 多孔板96 well plate for PCR
Z374911PCR 多孔板384 well PCR plate, polypropylene, skirted, non-sterile, 50/cs
RDRTReadyScript? cDNA 合成混合物Complete reagent for first strand cDNA synthesis for RT-qPCR
R4526定量PCR参考染料100 ×, solution
货号 产品描述
S4438SYBR? Green JumpStart? Taq ReadyMix?for quantitative PCR, MgCI2 in buffer
S5193SYBR? Green JumpStart? Taq ReadyMix?for quantitative PCR, without MgCl2 in buffer
高通量 QPCR 用 SYBR? Green JumpStart? Taq ReadyMix?SYBR? Green qPCR reagent, passive reference dye included
SYBR? Green JumpStart? Taq ReadyMix? for Quantitative PCR, Capillary
FormulationSYBR? Green qPCR reagent for Roche LightCycler? capillary systems
S9194
S1816
Z722553ThermalSeal RT2RR? filmnon-sterile, sealing films for real-time qPCR
Z734438ThermalSeal RTS ? 封口膜for qPCR, storage & crystallization, non-sterile
W1754
水PCR Reagent
通用SYBR Green qPCR实验方案
