实验名称： 姓 名： 学 号： 系 别： 实验日期： 同组同学名单： 细菌总DNA提取、凝胶电泳检测 摘要：本试验通过提取细菌总DNA，并进行凝胶电泳检测，使我们学习到了细菌总DNA提取的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳方法
实验目的：
1. 学习细菌总DNA提取的原理和方法
2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法
实验材料：
1. 菌种：E. coli
2. 试剂：TE、溶菌酶溶液（20mg/ml）、10% SDS、蛋白酶K（20mg/ml）、5mol/L NaCl 、酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇
3. 仪器：高速台式离心机、紫外检测仪
4. 其他材料：离心管、无菌吸头 、移液器等
实验方法及步骤：
1. 取1.2ml细菌培养液，6000r/min 离心2min，去上清。
2. 加1.5ml溶菌酶溶液，做成悬液。
3. 37℃水浴20 min
4. 加入0.6ml 10%SDS（0.1mol/l Nacl，0.5mol/l Tris，10%SDS，pH=8）反复颠倒混匀10min，10000r/min离心10min，取上清（分两管，每管各0.6ml）
5. 用等体积苯酚：氯仿：异戊醇各抽提1次，混合均匀（颠倒50次），10000r/min 离心10min，吸上清0.4ml。
6. 加入10μl的3mol/l乙酸钠和0.8ml无水乙醇，-20℃沉淀DNA10min，12000r/min 离心10min，去上清。
7. 加入70%乙醇2ml，转动离心管，倒去液体，待乙醇挥发后（20min），用30μl TE溶解
8. 用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上，再加入1μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔
9. 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min
10. 电泳结束后取出凝胶，置EB 溶液中染色5~10min，清水漂洗
11. 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带
实验结果：
下图中标记“四1”的为我们所提取DNA条带，可见一条清晰条带，呈现一条迁移率很小的整齐条带。前端有大量DNA分子，稍亮。
实验结果分析：
本实验提取到的总DNA通过电泳分析证明DNA含量水平合适，可以用于PCR实验。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 。
大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁薄、肽聚糖含量低。经过溶菌酶处理后，肽聚糖的1，4-糖苷键断裂，细胞壁裂开，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体的充分的裂解。在有机溶剂（酚、氯仿）存在时，核酸结合蛋白会发生变性，从核酸分子上解离下来，而由于核酸分子携带有大量负电荷，极性较强，当体系分相时会保留在水相中。在实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA
细菌总DNA提取以及凝胶电泳检测
