引物设计依据和软件操作
初做实验关于引物的设计一头雾水，但今天看到了这个帖子，很好，从中学到了很多的理论知识，还有很高的总结内容，便于学习和迅速进行实战操作（primer primer and oligo6），为实验设计引物的学生提供了很好的参考。
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增 加[2]。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest
neighbor method) [6][7]。
6. ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数 商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在 这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以 “Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“ector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件 的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo” 进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
功能 1. 2. 3.
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、 限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源
性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并
引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。
4.
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见 结构氨基酸中的18
种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会 遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结 构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒 体（Inertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（ertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功 能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列 等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按， 这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物 (Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分 为100，即各指标基本都能达标（如下图）。点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引 发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最 好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。 如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。
Oligo 6.22 使用技巧简介
1.
功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最着名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo .22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.
使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发6的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动
初级引物设计及简易的操作
