PTEN和MMP-9在胃癌组织中的表达及其临床意义
吉勇1 ，熊兵红1
，2*
，马利3 ，夏平1，杨胜1 ， 张才全2
Δ
1重庆市巴南区第二人民医院外一科（重庆，400054） 2重庆医科大学附属第一医院普外科(重庆，400016) 3重庆市巴南区第二人民医院内科(重庆，400054)
熊兵红*为并列第一作者。通讯作者：张才全，E-mail：
Δ
【摘要】 目的 检测PTEN和 MMP-9在胃癌中的表达，观察其与胃癌临床病理因素的关系及两者的相关性。方法 应用免疫组化法检测80例胃癌及其癌旁正常组织PTEN基因和MMP-9蛋白的表达。结果 胃癌组织PTEN蛋白表达的阳性率（50.0%，40/80）明显低于相应正常组织（100%，15/15）（P<0.01），其表达水平与组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关（均P<0.01）。胃癌组织MMP-9蛋白表达的阳性率（75.0%, 60/80）明显高于相应正常组织（20%，,3/15）（P<0.01），其表达水平随胃癌浸润深度增加、淋巴结转移及TNM分期的进展而增高（均P<0.01）。PTEN蛋白表达强度与MMP-9蛋白表达强度之间呈明显负相关(r=-0.257，P=0.019)。 结论 提示抑癌基因PTEN的表达与胃癌生物学行为密切相关；在胃癌发生、发展过程中，可能由于PTEN蛋白的低表达或失表达，不能有效抑制MMP-9的异常激活，促进了癌细胞的浸润、转移。
【关键词】 胃癌； PTEN；MMP-9；免疫组织化学
Expression of PTEN and matrix metalloproteinase-9 and their significances in gastric carcinoma Abstract
AIM: To study the expression of PTEN and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in gastric cancer, and to discuss their roles and correlations in the occurrence, development, invasion and metastasis of gastric cancer.
METHODS: SP immunohistochemistry was used to measure the expression of PTEN and MMP-9 in 80 samples of gastric carcinoma selected from paraffin wax embodied specimens with complete clinicopathological data, and another 15 cases of normal gastric mucosa.
RESULTS: The expression of PTEN in gastric cancer was low (50.0%，40/80), and reduced
with the increased invasive depth (P<0.01) and clinical stages (P<0.01), reduced histological differentiation (P<0.01) and occurrence of lymph node (P<0.01) and long distance metastasis (P<0.01). The expression of MMP-9 in gastric cancer was high (75.0%, 60/80), and increased with increased invasive depth (P<0.01) and clinical stages (P<0.01), reduced histological differentiation (P<0.01), and occurrence of lymph node metastasis (P<0.01). The expression of PTEN and MMP-9 (r=-0.257，P =0.019)was in inversely correlation in gastric cancer.
CONCLUSION: PTEN is lowly expressed in gastric caner, while MMP-9 is highly expressed. PTEN and MMP-9 are involved in the carcinogesis, devlopment and invasion of gastric cancer.
Key Words: Gastric cancer; PTEN; Matrix metalloproteinase-9; Immunohistochemistry
胃癌的发生、发展是一个多因素、多步骤的过程, 涉及到癌基因、抑癌基因表达的失调, 细胞凋亡、细胞运动和迁移调控的异常等多方面机制。PTEN(又称MMAC1/TEP1)基因是1997年第一个被发现的具有双重特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因, 在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面起着重要的调控作用, 而且在肿瘤发生发展及转移中均起抑制作用[1]。细胞外基质和基底膜降解是恶性肿瘤浸润和转移的关键环节, MMPs的作用底物是细胞外基质和基底膜中的纤维网架分子, 其中MMP-9可特异性地降解其中的Ⅳ型胶原。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是基质金属蛋白酶家族中分子质量最大的酶, 其主要作用是降解细胞外基质中的Ⅳ型胶原, 导致肿瘤的侵袭转移及血管形成。本研究通过检测抑癌基因PTEN在胃癌中的表达状况，观察其与胃癌临床病理因素的关系及与MMP-9蛋白表达的相关性，探讨PTEN和MMP-9在胃癌发生、发展过程中的作用及临床意义。 1 材料和方法
1.1 材料 2009-2010年手术切除, 病理证实为腺癌, 临床及病理资料齐全的胃癌蜡块标本80例, 术前均未行化疗或放疗。 男67例, 女23例; 年龄36-78岁; 肿瘤的原发灶大小、深度(T)、淋巴结转移(N)由病理确定, 远处转移(M)由病理学和临床确定。其中肿瘤浸润深度在浆膜下者23例, 浸透浆膜者57例; 组织学分型: 高分化28例, 中分化24例, 低分化28例; 局部淋巴结无转移43例, 有转移37例; 远隔无转移63例, 有转移17例. 根椐1997年国际抗癌联盟(IUCC)制定的TNM分期标准进行临床分期, Ⅰ期18例, Ⅱ期20例, Ⅲ期21例, Ⅳ期23例. 另取正常胃黏膜组15例作对照, 标本取自胃溃疡或十二指肠溃疡手术标本中正常的胃黏膜组织, 并经病理观察证实且排除重度不典型增生。男10例, 女5例, 年龄40-77岁.
1.2 方法 常规HE染色, 确定标本的组织分化程度. 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法检测PTEN, MMP-9在胃癌及正常胃组织中的表达. 具体操作步骤按常规进行, 其一抗工作稀释度: PTEN为1∶75, MMP-9为1∶100, 用已知阳性的切片作为阳性对照, PBS缓冲液代替一抗作阴性对照. 以细胞质内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞. 先于低倍镜下观察, 排除肿瘤坏死出血区及边缘反应区, 于肿瘤内染色相对密集区选取5个视野分别进行细胞计数, 高倍镜下进行观察, 以阳性细胞数占同类计数细胞的百分比为阳性细胞率。按阳
性细胞率, 将2种蛋白染色结果进行半定量测定, (1)PTEN: 阴性(-): 阳性细胞率<5%; 弱阳性(+): 阳性细胞率为5%-25%; 阳性(++): 阳性细胞率为25%-50%; 强阳性(+++): 阳性细胞率>50%. (2)MMP-9: 于肿瘤侵袭边缘及肿瘤内染色相对密集区选取5个视野, 阴性(-): 无明显的阳性细胞; 弱阳性(+): 阳性细胞率<25%; 阳性(++): 阳性细胞率为25%-75%; 强阳性(+++): 阳性细胞率>75%。
1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0软件包进行统计分析. PTEN, MMP-9为计数资料, 各个相关因素的差异性比较采用χ2检验. PTEN, MMP-9各指标间的相关性研究采用相关分析.各检验方法皆以P<0.05为差异显著标准.
2 结果
2.1 PTEN在胃癌组织中的表达 PTEN蛋白染色阳性反应信号呈棕黄色细小颗粒，位于细胞质（见图1)。胃癌组织中PTEN蛋白表达的阳性率50.0%(40/80),显著低于癌旁正常胃黏膜 100%（15/15），两组间有差异统计学意义（χ2=12.95，P<0.01，表1），与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、远隔转移、临床分期呈负相关(P<0.05), 随肿瘤浸润深度的加深、淋巴转移的产生、远隔转移的发生、临床分期的提高而降低; 与肿瘤的病理分化程度呈正相关(P<0.05), 随肿瘤病理分化程度的降低而降低（表2）。与患者的性别、年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05)。
A B
图1 PTEN在正常胃组织及胃癌中的表达 (×400). A: 正常胃组织中PTEN呈阳性表达; B: 胃癌组织中PTEN呈阴性表达.
2.2 MMP-9在胃癌组织中的表达 MMP-9蛋白染色阳性反应信号呈棕黄色细小颗粒，位于细胞浆（见图2)。胃癌组织MMP-9蛋白表达的阳性率75.0%( 60/80）明显高于相应正常组织20%（3/15）（χ2=17.11，P<0.01，表1）。主要表达于癌巢和正常组织交接部位, 癌细胞及间质细胞都有表达, 多定位于胞质。与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴转移、临床分期呈正相关(P<0.01), 随肿瘤浸润深度的加深、淋巴转移的产生、临床分期的提高而明显增高; 与肿瘤的病理分化程度呈负相关(P<0.01), 随肿瘤病理分化程度的降低而增高（表2）。 而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、远隔转移无相关性(P>0.05)。PTEN和 MMP-9表达与胃癌临床病理因素的关系见表2.
A B
图2 MMP-9在正常胃组织及胃癌中的表达 (×400). A: 正常胃组织中MMP-9呈阴性表达; B: 胃癌组织中MMP-9呈阳性表达.
2.3 PTEN与MMP-9的相关性 在80例胃癌中，MMP-9和PTEN同时表达阳性的例数为22例，同时表达阴性的例数8例，MMP-9阳性而PTEN阴性者38例，MMP-9阴性而PTEN阳性者15例。Spearman相关分析显示，两者在结胃癌中的表达呈显著负相关(r=-0.257，P=0.019，表3)即随着PTEN蛋白表达强度的增加，MMP-9蛋白表达强度减弱，反之亦然。
表1 PTEN与MMP-9在胃癌及癌旁正常组织中的表达 组别
n
对照组 15 CRC
表2 PTEN和MMP-9表达与胃癌临床病理因素的关系
病 理
因 素
n 23 57 28 24 28 43 37
PTEN (%) 19（82.61） 21（36.84）b 17（60.71） 17（70.83） 6（21.43）b 30（69.76） 10（27.02）b
MMP-9 (%) 12（52.17） 48（84.21）b 15（53.57） 19（79.16） 26（92.86）b 26（61.46） 34（91.89）b
MMP-9
+ 阳性率(%) χ2 P值
PTEN
+ 阳性率(%) χ2 P值
3 60
20 75
17.11
P<0.01
15 40
100 50
12.95
P<0.01
80
浸润深度 分化 淋巴转移
浆膜下 浸透浆膜 高 中 低 无 有
远隔转移
TNM分期
无 有 Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅳ
63 17 38 42
38（60.32） 2（11.76）b 29（76.31） 11（26.19）b
46（73.01） 14（82.35）a 22（57.89） 38（90.48）b
a: P>0.05， b: P <0.01.
表3 胃癌中MMP-9和PTEN表达的关系
MMP-9 + -
PTEN
+ - 22 15
38 8
-0.257
0.019
R值
P值
3 讨论
目前研究认为, 胃癌的发生、发展是多因素、多阶段、多因子的复杂过程, 在此过程中癌基因的激活与抑癌基因的丢失或表达失调是其重要特征。抑癌基因PTEN即与张力蛋白同源的、第10染色体丢失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome10, PTEN)基因，又名MMAC1基因,是1997年Li和Steck et al 3个研究小组[2-4]分别发现并命名的第1个具有磷酸酯酶活性的抑癌基因。该基因定位于染色体10q23.3上, 其主要结构功能区位于N端, 是由403个氨基酸组成的一条多肽链, 具有与细胞张力蛋白和辅助蛋白同源的序列, 其编码的蛋白具有蛋白性磷酸酯酶活性和脂性磷酸酯酶活性, 参与细胞生长调节, 并在肿瘤细胞浸润、血管发生及肿瘤转移中起一定作用[5]. 大多数研究表明, 在人类许多恶性肿瘤细胞中存在PTEN的杂合性丢失(LOH), 并与肿瘤进展有关[6]。 PTEN在多种良恶性肿中均可以检测到突变与缺失, 胃癌中也可以检测到PTEN表达的异常[7]。将野生型PTEN基因转导到肿瘤细胞中, 会发现肿瘤细胞的生长明显受到抑制[8]。Sano et al[9]发现, PTEN蛋白表达高低与患者的病理分级及预后有关, 预后越差, 恶性程度越高, PTEN蛋白表达水平越低. 我们发现, PTEN在胃癌组织中的表达率明显低于在正常胃组织中的表达, 并随肿瘤病理分化程度的
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