N-乙酰半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞eNOS的保护作用
王凌霄 王阿磊 丁 菁 张 倩 黄 华 姜君财 陆德琴
【摘 要】〔摘 要〕 目的 探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的保护作用及可能的分子机制。方法 HUVECs随机分为正常对照组、血管紧张素(Ang)Ⅱ组、单纯NAC组和NAC预处理+AngⅡ组。用Western印迹法检测eNOS蛋白、eNOS Ser1177磷酸化水平、蛋白磷酸酶(PP)2A-Cα、PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A表达水平，化学比色法检测细胞组成型一氧化氮合酶(cNOS)活性及培养基中一氧化氮(NO)含量。结果 AngⅡ刺激后eNOS Ser1177、PP2A-c Y307水平和I2PP2A表达水平降低(P<0.05)，cNOS活性、NO含量均降低(P<0.05)；NAC预处理后上述变化均被逆转。结论 NAC预处理可上调PP2A-c Y307和I2PP2A水平，从而降低PP2A活性，最终保护eNOS活性。 【期刊名称】中国老年学杂志 【年(卷),期】2018(038)006 【总页数】5
【关键词】〔关键词〕 N-乙酰半胱氨酸；人脐静脉内皮细胞；内皮型一氧化氮合酶；蛋白磷酸酶2A
内皮功能障碍(ED)是心血管疾病发生发展的共同始动因素，氧化应激损伤是导致ED的主要原因之一〔1〕。生理情况下血管内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)在维持血管稳态中起着重要的作用，NO在一氧化氮合酶(NOS)的催化下产生，主要来源于内皮型NOS(eNOS)。ED的重要表现之一是eNOS/NO功能受损，其机制可能与eNOS活性下降及NO生物利用度降低有关。蛋白磷酸酶(PP)2A
是目前已知还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(Nox)源性活性氧(ROS)的主要靶蛋白之一，也是使eNOS Ser1177/1179去磷酸化的主要磷酸酶〔2〕。研究发现N-乙酰半胱氨酸(NAC)作为一种ROS清除剂可以减轻氧化应激，对血管形态及功能起到保护作用〔3〕。血管紧张素(Ang)Ⅱ可通过多种途径产生大量的ROS，从而造成ED〔4〕。本研究对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)给予AngⅡ刺激，同时使用NAC对HUVECs进行预处理，初步探讨NAC预处理对内皮细胞eNOS活性的保护作用及机制。
1 材料和方法
1.1 实验试剂及仪器 HUVECs由贵州医科大学曾柱教授惠赠；胎牛血清(FBS)、无酚红高糖DMEM培养基(Gibco)；高糖DMEM培养基、青-链霉素、0.25%胰蛋白酶(HyClone)；NAC、AngⅡ(Sigma)；聚氟偏乙烯(PVDF)蛋白杂交膜(Millipore)；电化学发光法(ECL)增强化学发光试剂盒(Bio-Rad)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo)；鼠抗人eNOS抗体(BD)；兔抗鼠eNOS Ser1177抗体(Millipore)；兔抗鼠PP2A-c Y307抗体(Abcam)；兔抗鼠PP2A-Cα抗体、羊抗兔I2PP2A抗体、兔抗鼠β-tubulin抗体、辣根过氧化酶标记的羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠Ⅱ抗、兔抗羊Ⅱ抗(Santa Cruz)；兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体、兔抗人CD34抗体(北京博奥森生物公司)；链霉亲合素-生物素复合物(SABC)法检测试剂盒(北京中杉金桥公司)；BX41显微镜、倒置荧光显微镜(OLYMPUS)；ROS检测试剂盒(碧云天)；NOS分型测定及NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2 HUVECs细胞培养 HUVECs接种于无菌25 cm2培养瓶中，于37℃、5 %CO2的培养箱中用含10% FBS高糖DMEM培养基培养，每48 h更换一
次培养液，当细胞生长达到80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代。实验取4～10代的细胞。
1.3 细胞鉴定 细胞爬片后，于六孔板中培养。待密度至50%左右时，用无FBS培养基静止12 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，采用4%多聚甲醛固定，用兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体和兔抗人CD34抗体作为Ⅰ抗，1∶100稀释后，SABC法进行免疫细胞化学染色。PBS培养作为阴性对照。镜下胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。200倍显微镜下随机取5个视野计数阳性细胞，阳性细胞率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。 1.4 分组
1.4.1 单纯AngⅡ处理实验 HUVECs随机分为正常对照组和AngⅡ组(AngⅡ浓度分别为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L，处理12 h)。通过Western印迹检测eNOS Ser1177磷酸化水平，AngⅡ最终使用浓度取1×10-7 mol/L和1×10-6 mol/L，处理时间12 h进行实验。 1.4.2 NAC预处理实验 根据参考文献〔5〕，采用终浓度为1×10-3 mol/L的NAC预处理1 h，随机分为正常对照组、AngⅡ(1×10-7 mol/L和1×10-6 mol/L，处理12 h)组、单纯NAC组、NAC(预处理)+AngⅡ(1×10-7 mol/L、1×10-6 mol/L)组。
1.5 细胞内ROS的测定 于六孔板中培养HUVECs，随机分为正常对照组和AngⅡ组，作用12 h后去除细胞培养液，加入1.5 ml终浓度为10 μmol/L的荧光探针二氯荧光磺双乙酸盐(DCFH-DA，使用无FBS培养基稀释)，于37℃、5%CO2的培养箱内孵育20 min，用无FBS培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用488 nm激发波长、525 nm发射波长于
N-乙酰半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞eNOS的保护作用
