海洋来源细菌CB101抗肿瘤活性次级代谢产物的初步研究
蔡生新1，李德海1，朱天骄1，王凤平2，肖湘2，顾谦群1*
（1．教育部海洋药物重点实验室，中国海洋大学医药学院，青岛，266003；2. 海洋生物遗传重点实验室，国家海洋局第三海洋研究所，厦门)
摘要：目的 阐明海洋来源细菌CB101(Aeromonas sp.)的化学成份及其抗肿瘤活性。方式 对海洋来源细菌CB101(Aeromonas sp.)的总提取物采取硅胶柱色谱、凝胶柱色谱及半制备HPLC等分离手腕进行活性追踪分离，通过理化性质及波谱学手腕进行化学结构鉴定，以SRB及MTT法评价化合物的抗肿瘤活性。 结果与结论 从海洋来源细菌CB101(Aeromonas sp.)的发酵产物中共分离取得9个吲哚衍生物类化合物（1-9），其化学结构别离鉴定为4-[bis-(3-indolyl)methyl]quinoline (1)，2,2-bis(3-indolyl)ethyl-butyrate (2), 4-(3-indolyl)
hexan-2-one (3)，吲哚 (4)，trisindoline (5)，indole-3-ethanol (6)，2,2-di(3-indolyl)-3-indolone
(7)，2-[2,2-bis(1H-indol-3-yl)-ethyl]phenylamine (8)，1,1,1-tris(3-indolyl)methane (9), 其中化合物1-3为新化合物且具有较弱的抗肿瘤活性。
关键词：海洋来源真菌；次级代谢产物；吲哚衍生物； 抗肿瘤活性
Primary Investigation of Antitumor Secondary Metabolites of Marine Derived Bacterium, Aeromonas sp. CB101
CAI Sheng-xin1, LI De-hai1, ZHU Tian-jiao1, WANG Feng-ping2,XIAO Xiang2, GU Qian-qun1* (1. Key Laboratory of Marine Drugs, Chinese Ministry of Education; Institute of Marine Drugs and Food, Ocean
University of China, Qingdao 266003, . China;2. Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources, Third Institute of Oceanography, The State Ocean Administration, Xiamen, . China)
ABSTRACT: OBJECTIVE Investigation of the secondary metabolites of marine derived bacterium CB101(Aeromonas sp.) and evaluate their antitumor activity. METHODS Bioactive fractions were obtained from the crude extract of CB101(Aeromonas sp.) through a bioassay-guided fractionation and the chemical constituents of the fractions were investigated and purified by the combined use of column chromatography with silica gel and Sephadex LH-20, the preparative HPLC. Their structures were established by spectroscopic methods. Their antitumor activities were evaluated by SRB and MTT methods. RESULTS AND CONCLUSION Nine indole-derived compounds (1-9) were isolated and identified as 4-[bis-(3-indolyl)methyl]quinoline (1)，2,2-bis(3-indolyl)ethyl-butyrate (2), 4-(3-indolyl) hexan-2-one (3)，indole (4)，trisindoline (5)，indole-3-ethanol
(6)
，
2,2-di(3-indolyl)-3-indolone
(7)
，
2-[2,2-bis(1H-indol-3-yl)-ethyl]phenylamine (8)，1,1,1-tris(3-indolyl)methane (9), respectively. Among these compounds, 1-3 are new compounds and they have weak antitumor activity. Key words: marine derived bacterium; secondary metabolites; indole-derived compounds;
antitumor activity
海洋微生物多生活在高盐、高压、低营养、低温(专门是深海)和无光照等特殊环境当中,为适应这些生命的极限环境, 海洋微生物已进展出独特的代谢方式,也使其产生的海洋天然产物具有种类繁多、结构特异及活性强等特点,这为寻觅海洋生物活性物质提供了丰硕的源泉。最近几年来，从海洋来源的微生物中寻觅结构新颖、活性独特的生物活性物质日趋成为新药发觉的重要研究领域。[1-4]
本实验室从海洋来源的微生物中追踪新的活性物质的研究中，取得一株分离自厦门海域海水样品的细菌CB101，这株细菌经鉴定为Asromonas sp.，它的乙酸乙酯提取物对K562细胞具有专门好的抑制活性%)。本实验从细菌CB101发酵物中分离取得3个新的吲哚衍生物类化合物4-[bis-(3-indolyl)methyl]quinoline (1)，2,2-bis(3-indolyl)ethyl-butyrate (2) , 4-(3-indolyl) hexan-2-one (3)和6个已知化合物indole(4)，trisindoline(5)，[5] indole-ethanol(6)，[6] 2,2-di(3-indolyl)-3-indolone (7)，
[7] [9]
[8] 2-[2,2-bis(1H-indol-3-yl)-ethyl]phenylamine(8)，1,1,1-tris(3-indolyl)methane(9)，
利用MTT [10]及SRB [11]法评价了化合物的抗肿瘤活性。
1. 实验部份
仪器和试剂
MarinerAP I2TOF型质谱仪；JNM2ECP600型核磁共振仪(日本JEOL公司)；分析用高效液相色谱仪：Waters公司产品(Waters 600泵,Waters 996二极管阵列检测器, Millennium32工作站, YMC-pack ODS (A)， × 250 mm，5μm，1mL/min)；半制备高效液相色谱：日本岛津公司产品 （LC-6AD泵，SPD-M20AVP检测器，SCL-10AV型系统控制器，YMC-pack ODS (A)，10 × 250 mm，5μm，4 mL/min）；Sephadex LH-20：Pharmacia公司；硅胶H（200～400目）：青岛海洋化工厂产品。LiChroprep? RP-18（25-40 ?m）：Merck公司产品。活性测试采用白血病细胞HL-60和人肺腺癌细胞A-549。磺酰罗丹明B （SRB）为Sigma公司产品。
常规提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均为工业用化学纯产品，重蒸后利用，液相色谱甲醇为色谱纯。
菌种发酵及提取物的取得
将细菌CB101接种于含有300mL生产发酵培育液（0.5 g蛋白胨，0.1 g酵母浸膏，0.1 g FePO4，1L陈海水，pH ）的500 mL三角瓶中，将盛有100L这种生产发酵液及菌种的三角瓶置于20 ℃、100 rev/min的摇床中发酵3天，取得发酵培育液。将菌株的发酵培育液离心（5000 g，30 min）,分为上清液和菌丝体. 取上清液,直接用100L乙酸乙酯萃取三次,归并萃取液,得乙酸乙酯萃取液,减压浓缩至干,得粗浸膏（15.0 g）。
化合物的分离
取粗浸膏(15.0 g)通过硅胶（300-400目）柱层析，利用石油醚/氯仿和氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，取得六个组分。通过硅胶柱层析，石油醚：丙酮 20:1洗脱，取得化合物4 (5 g)；（150 mg）通过硅胶柱层析，石油醚/丙酮梯度洗脱，再经半制备液相色谱(70% CH3OH, 4 ml/min)纯化取得化合物2 mg, tR min)、化合物3 mg, tR min)和化合物9 (15 mg, tR min)；通过Sephadex LH-20柱层析（氯仿/甲醇，1:1）分成五个亚组分，亚组分2再经半制备液相色谱(70% CH3OH, 4 ml/min)纯化取得化合物1 (50 mg, tR min)；亚组分3再经半制备液相色谱(70% CH3OH, 4 ml/min)纯化取得化合物6 mg, tR min)，化合物7 (10 mg, tR min)和化合物8 (10 mg, tR min)；通过Sephadex LH-20柱层析（氯仿/甲醇，1:1），再经半制备液相色谱(70% CH3OH, 4 ml/min)纯化取得化合物5 (7 mg, tR min)。化合物的结构见。
化合物活性测试
海洋来源细菌CB101抗肿瘤活性次级代谢产物的初步研究
