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稳定性同位素稀释技术结合GC-MS测定酱油多组分氯丙醇的研究
傅武胜
1
1，2
吴永宁 赵云峰张磊 唐昌东
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（中国疾病预防控制中心营养与食品安全所，北京,100050,） (福建省疾病预防控制中心，福州，350001)
摘要 本文首次建立了用两种同位素内标同时测定酱油中4种氯丙醇的GC－MS方法， 样品中加入稳定性氘代同位素内标，采用硅藻土固相层析净化酱油样品，经七氟丁酰衍生化后得到分析物，衍生物在DB-5毛细管柱中经程序升温得到良好的分离，用选择离子存储（SIS）定量。进样量为20～500pg时，峰面积比值与氯丙醇浓度呈线性关系，相关系数均大于0.999，3-氯－1，2-丙二醇（3-MCPD）、二氯丙醇（1,3-DCP、2,3-DCP）的最低检出限分别为0.003、0.005mg/kg；3种浓度水平下加标重复测定6次，3-MCPD的精密度、回收率分别为6.99～16.2%，98.8～115%；1,3-DCP为3.80～9.25%，75.0～119%；2,3-DCP为7.07～10.4%，93.6～132%，满足了酱油样品中痕量氯丙醇的分析要求。 关键词 气相－质谱（GC/MS）， 氯丙醇， 酱油
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前 言
氯丙醇是一种食品污染物，3-氯－1,2-丙二醇（3-MCPD）可使大鼠致癌, 在体外具有遗传毒性，Olsen[1]和Lynch等[2]对此作了全面的概述，JECFA制定了暂定每日最大耐受量（TDI）为2μg/kg.bw[3]，1,3-二氯－2-丙醇（1,3-DCP）为动物遗传毒性致癌物。已经发现各类食品中都有3-MCPD污染，但主要是酸水解植物蛋白（HVP）及含HVP的配制酱油中氯丙醇污染严重，许多国家已经制定了3-MCPD或1,3-DCP的限量标准或临时性措施[4] ，一般要求3-MCPD低于
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1.0mg/kg，欧盟要求低于20μg/kg []，这使得对检测方法提出了很高的要求。最初采用二氯荧光
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黄喷雾的薄层层析法来半定量测定HVP中mg/kg级的3-MCPD酯[]，也有采用毛细管电泳方法[]，其它基本采用气相色谱或气相－质谱联用法定量，大多数只能测定单一的单氯取代氯丙醇（3-MCPD、2-MCPD）[8~17]或双氯取代氯丙醇（1,3-DCP）[18~20]，也有一些同时测定多组分氯丙醇的文献[21~26]，但仅Chung等[24] 以单一同位素d5-3-MCPD为内标测定调味品中的3种氯丙醇，国内外尚无采用两种同位素内标同时测定酱油中4种氯丙醇的报道。
材料与方法 1试剂
除非另有说明，分析中使用的均为分析纯的试剂。 正己烷（Fisher公司，农残级）、乙醚、正己烷、氯化钠、无水硫酸钠（105℃烘烤3小时后使
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用）、Extrelut20硅藻土填料（德国Merck公司）、七氟丁酰基咪唑（HFBI，美国Pierce公司）、3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）（25ml,Aldrich Chemicals InC.）、1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP,Fluka)
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和2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP,97.0%,Fluka)、稳定性同位素d-3-氯-1,2-丙二醇标准品
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（98%,1ml,Isotec InC.）、d-1,3-二氯-2-丙醇标准品(d-1,3-DCP，98%,5g,Cambridge Isotope LaboratoriesInC.)、超纯水、工业氮气（纯度>99.5%,用于溶液的浓缩）、高纯氦气（纯度>99.9995%，GC-MS分析用载气）。饱和氯化钠溶液（5mol/L）
氯丙醇混标溶液：用乙酸乙酯分别配制3-MCPD、1，3-DCP、2,3-DCP标准储备液（1000mg/L），用农残级正己烷配制中间溶液（100 mg/L），最后用正己烷配成浓度为2.00mg/L的混合标准使用液。
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氯丙醇内标混合液：用乙酸乙酯分别配制d-3-MCPD 、d-1,3-DCP的储备液（1000 mg/L），最后用农残级正己烷配成浓度为10 mg/L的混合内标使用液。 2仪器与装置
CP-3800气相色谱仪，Saturn 2000质谱仪（Varian公司）、CP-8200自动进样器、玻璃层析柱（40cm×2cm i.d.）、旋转蒸发仪、111型N2-浓缩器、Pwsio―002型数显保温培养箱、G-560E型漩
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涡振荡器、AE 160型分析天平（准确至0.1mg，瑞士Mettler公司，用于配制标准溶液）、AR2130/c型Advanturer电子精密天平（准确至1mg，上海奥豪斯公司，用于称取样品），1.0ml气密注射器、50μl微量注射器，100μl微量进样器、超纯水器、B-2200E1型超声波清洗器。所有玻璃器皿、用具首次使用前用重铬酸钾洗液浸泡8小时后用重蒸馏水冲洗干净，凉干后使用。 3待测液制备 3.1内标加入
液体样品：称取样品4.00g～8.00g，置100ml烧杯中，加入d5-3-MCPD、d5-1,3-DCP内标混合溶液（10 mg/L）20?l，加饱和氯化钠溶液2g，超声10分钟。
汤料或固体与半固体植物水解蛋白：称取样品2.00~4.00g，置100ml烧杯中，加内标混合液（10 mg/L）100?l，加饱和氯化钠溶液4g，超声15分钟，减压抽虑，用饱和氯化钠溶液多次洗涤残余物至滤液为10.0ml（最终取1/5的溶液用于衍生）。试剂空白用饱和氯化钠溶液（5 mol/L） 10ml，其余同样品操作。 3.2样品提取
将净化中所用正己烷：乙醚（9+1）改为纯正己烷，用量为40ml，其余同GB/T5009.191-2004（浓缩以及吹氮气时不能蒸干，否则双氯取代氯丙醇将全部流失）。 3.3衍生化：同GB/T5009.191-2004 4测定方法
4.1色谱、质谱条件
GC条件: DB-5MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.30μm），进样口温度：280℃；进样：1μl，不分流进样；
2℃/min40℃/min程序升温条件：50℃，1min????90℃?????250℃，5min；载气流量：氦气，恒
4psi/min4psimin压模式，10psi（定量时用程序流量，2psi，8min????。 ?15psi?????5.0psi,8.25min）
全扫描MS条件：电子倍增器偏离：＋100V，灯丝电流：25μA，离子化方式：EI，70eV；溶剂延迟：10min；target TIC：650000，max ioniation：65000μsec，prescan ionization time：100μsec，background mass：70m/z，RF Dump Value：650m/z，阱温度：220℃，传输线：250℃，manifold：48℃，全扫描质量数范围：m/z70~300（对于1,3-DCP，2,3-DCP，d5－1,3-DCP），m/z70~460（对于d5－3-MCPD、3-MCPD）， 扫描时间：0.63sec/ scan，质谱采集时间为12~18 min。
定量分析MS条件：电子倍增器偏离：＋150V，灯丝电流：50μA，其余参数同定性分析，离子制备如下：
扫描时间段 质量数范围 扫描时间 片断1（d5-1,3-DCP，1,3-DCP）： 10~12min m/z70～285 0.53sec/ scan 片断2(2,3-DCP)： 12~13min m/z70~260 0.51sec/scan 片断3(d5-3-MCPD、3-MCPD、2-MCPD): 13~15min m/z250~460 0.53 sec/scan 扫描方式：采用选择离子存储（SIS）方法，氯丙醇及其内标的定量离子见表1。氯丙醇的定性鉴定要求是：3-MCPD的5个离子（m/z253、275、289、291、453）中至少两个离子的强度比不得超过标准溶液的相同离子强度比的±20%；对于2-MCPD，要求特征离子m/z 289、291丰度比在2.5~3.5之间，对于1,3-DCP,要求m/z 275、277的丰度比在2.5~3.5之间，2,3-DCP的m/z75、77不作特别要求。
4.2结果计算
以各系列标准溶液的浓度（ng）与对应的氯丙醇和内标的峰面积比绘制标准曲线，按内标法计算样品中氯丙醇含量，3-MCPD、2-MCPD用d5-3-MCPD内标，1,3-DCP、2,3-DCP用d5-1,3-DCP内标。计算结果表示到三位有效数字，平行测定的相对偏差不得超过算术平均值的20%。
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结果分析
1定量离子的选择
氯丙醇及同位素内标衍生物的全扫描图见图1；表1为衍生物的离子化产物分析。3-MCPD、2-MCPD的m/z253离子较其它特征离子灵敏度高5～10倍，且在本系统下没有干扰，因此作为定量离子；1,3-DCP 以m/z275+277定量，其灵敏度、选择性、峰形明显优于采用m/z75+77，其同位素
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内标d-1,3-DCP采用m/z278+280定量；对于2,3-DCP，尽管用m/z253定量信噪比较高，标准曲线线性亦较好，但样品在该峰处存在极明显的干扰，因此采用m/z75＋77定量。
表1 氯丙醇及其同位素内标衍生物的EI离子化产物分析[21,24]
名称 分子量[M-CH2Cl][M-CL－HCl] [M-C3F7CO2] [M-C3F3CO2CH2][M-C3F7CO2-HCL][M-C3F7CO2-CH2CL][M-C3F7CO2- C3F7CO2H]
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33-MCPD 502 453 - 289/291 275/277 253* 240 75/77 22-MCPD 502 - 289/291 – 253* - 75/77 Dd5-3-MCPD 507 456 – 294/296 278/280 257* 243 79/81 11,3-DCP 324 275/277* － 111 - 75/77 --
D5-1,3-DCP 330 278/280* － 116 – 79/81 - -
22,3-DCP 324 - 253 111 - 75/77* - -
注：带*者为定量离子
图1 氯丙醇及其同位素内标七氟丁酰衍生物的全扫描质谱图（a）d5－1,3-DCP；（b）1,3-DCP；（c）2,3-DCP；
（d）d5－3-MCPD；（e）3-MCPD；（f）2-MCPD。
2色谱条件的选择
在本实验选定的色谱分离条件下，所有4种氯丙醇以及2种内标均能得到较好的分离（见图2酱油样品衍生物提取离子色谱图），采用提取离子定量后目标化合物周围基本没有干扰物,在11.5min开始出峰，2-MCPD最后出峰，保留时间为14.4min。
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氯丙醇(dcp、mcpd的gc-ms同时测定-20042.2-杂志用-改-缩
