鸡贫血病毒广州株VP3和VP1基因的克隆与序列分析
沈海燕1，张建峰1，刘志成1，周恒1,2，郭翠丽1,2，郭鹏举1，张春红1* 【摘 要】摘要：采用PCR方法成功克隆了3株鸡贫血病病毒（CAV）广州株VP3和VP1的部分基因，并进行了核苷酸序列测定。序列分析表明，3株CAV广州株与国内外其他21株CAV毒株的核苷酸序列相似性在89.5%～100.0%之间；推导氨基酸序列的相似性在84.8%～98.2%之间。系统发育进化树分析显示，3株CAV广州株和中国TJBD40、SD22、SD24株都同处于一个分支上，而与马来西亚的SMSC-1株、日本的G6株以及澳大利亚的CAU269/7株的亲缘关系较远。
【期刊名称】广东畜牧兽医科技 【年(卷),期】2015(040)002 【总页数】4
【关键词】鸡贫血病病毒；核苷酸序列；分子进化树
鸡传染性贫血病(c hi c ke n inf e c ti o us a n emi a，C I A)是由鸡贫血病毒(c hi c ke n a n e mi a v i rus，C A V)引起的损害鸡的造血器官和淋巴器官组织的免疫抑制病。病鸡容易继发病毒、细菌和真菌感染[1]。本病以垂直传播为主，水平传播一般不引起发病。成年鸡感染C A V后常呈亚临床带毒状态，对养鸡业构成潜在的巨大威胁。我国自从崔现兰等[2]1992年首次报道该病以来，广西、安徽、山东[3-5]等地也陆续报道了鸡群中该病的流行。
C A V是圆环病毒科的单股环状D N A病毒，其基因组可编码3种蛋白质，VP1、VP2和VP3。其中，VP1是C A V的衣壳蛋白和主要免疫原蛋白[6]；VP2是非结构蛋白，在刺激机体产生中和抗体方面起到辅助作用，在病毒子的
组装过程中充当一个折叠蛋白，但病毒装配为成熟粒子后逐渐消失[7]；VP3是C A V的另一种非结构蛋白，能够诱导癌变的细胞发生调亡[8]。从毒株的抗原性来看，C A V均属于同一个血清型，但C A V分离株之间毒力不同，基因组序列也存在差异。本研究利用P CR技术，对广州地区的3株C A V毒株进行扩增，测定其VP3和VP1基因的部分序列，并与G e n B a n k收录的C A V毒株序列进行比较与分析。
1 材料与方法
1.1 病料
2014年5月从广州地区3个鸡场采集疑似感染C A V的病鸡的胸腺、脾、法氏囊等组织。 1.2 病毒DNA的提取
采集的疑似组织病料加5倍体积含青、链霉素的0.01 m ol/L(p H7.2)P B S研磨，反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min，收集上清经0.22μm微型滤菌器过滤除菌，收集滤液，按照T aka r a公司的M ini BE S T V ir a l R N A/D N A E xt r a c ti o n K it V e r4.0试剂盒的操作步骤提取病毒D N A。 1.3 PCR扩增
根据N C B I G e n B a n k收录的C A V C A U269/7毒株(G e n B a n k号：A F227982)的VP3和VP1基因序列设计了1对引物：P1 5′-C T C A CC AA G AA G A TA C T C-3′；P2 5′-GG C T G AA GG A T CCC T C A TT C-3′，预期扩增片段为1 027 b p。采用25μL的P CR反应体系，在0.2 m L P CR反应管内分别加入10×P CR B uf f e r 2.5μL，d N T P s(2.5m M)2.0μL，P1和P2引物(100 p m ol/μL)各1.0μL，5U/μL E x-T a q D N A聚合酶0.25μL，D
N A模板2.0μL，去离子水16.25μL。P CR反应程序为：94℃5 min；94℃3min、52℃40s、72℃10s，循环扩增35次；最后72℃延伸10 min。 1.4 PCR扩增产物的克隆
在1.0%琼脂糖凝胶上进行P CR产物电泳，将目的片段进行切胶回收和纯化，然后将纯化回收的P CR产物连接到p M D-18T载体上，转化T o p 10感受态细菌。挑取在含有氨苄青霉素(浓度为100μg/L)的选择培养基上长出的菌落，37℃培养，然后使用O ME G A公司的质粒D N A小量纯化试剂盒提取质粒。 1.5 序列测定、拼接与分析
将1.4获得的质粒送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，每个片段至少进行3次测序，以确保序列的可靠性。用D N A S t a r 5.0软件进行序列的拼接，最后获得完整的目的基因序列，并与G e n B a n k上其他C A V毒株的基因序列进行相似性比较。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
广州3个场疑似组织病料的P CR产物在1.0%琼脂糖中电泳20 min，可见清晰的与预期大小一致的约1 027 b p的特异性条带（见图1）。分别标记为C A V-1、C A V-2、C A V-3。
2.2 CAV毒株核苷酸序列的相似性分析
对3株C A V广州株的部分基因进行了核苷酸序列测定，发现C A V-2和C A V-3的核苷酸序列完全相同，C A V-1与C A V-2和C A V-3的相似性为99.6%。将3株C A V广州株的序列与G e n B a n k收录的21个C A V毒株的序列进行比较，发现24株C A V毒株核苷酸序列的相似性介于89.5%～
鸡贫血病毒广州株VP3和VP1基因的克隆与序列分析
