HBV基因分型和耐药突变基因检测

HBV基因分型和耐药突变基因检测

杨红起,鲁 荣,于本章△

【摘 要】摘 要：目的 探讨东营地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布，乙型肝炎患者耐药情况，HBV基因型别与耐药以及突变位点关系。方法 收集乙型肝炎患者血清300例，采用离心柱法提取HBV-DNA，聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法检测HBV分型和耐药突变。 结果 300例HBV-DNA阳性患者中，检出B型、C型、B/C型及其他未检测出的基因型，未检出D型分型，检出结果中以C型为主，占81.8%；HBV患者耐药药物以拉米夫定和替比夫定的联合耐药为主，占43.6%；HBV耐药突变基因型主要为rt204I(24.35%)、rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%)；B型和C型的耐药突变率分别为30.77%和42.42%，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 东营地区HBV基因C型多于B型，C型容易产生耐药，以rt204I，rt204V及rt180M基因突变型多见，拉米夫定和替比夫定的联合耐药多见，应根据基因分型和耐药突变结果对乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。 【期刊名称】国际检验医学杂志 【年(卷),期】2016(037)017 【总页数】3

【关键词】HBV分型； 耐药性； 耐药突变位点 ·论 著·

随着新型抗病毒药物的应用，乙型肝炎病毒(HBV)基因变异检测方法的更新，新的变异位点不断涌现，给临床医生的工作带来了很大的难题。尽管目前对HBV基因变异的研究取得了一些成果，但对于具有多个变异位点的HBV基因

组，研究还远远不够[1]。HBV基因型在乙型肝炎患者的临床表现、治疗预后和药物突变上都有一定的影响[2-3]。现有的一些研究成果尚存在争议，而且HBV基因组还会有新的变异点的出现，因此，HBV变异与临床的关系尚需要大量的临床标本，从病毒的全基因组出发来进一步研究。用发展的眼光看待HBV变异，将使人们对HBV变异及其临床意义的认识得到不断的深入和研究。本文对东营地区300例乙型肝炎患者检测结果进行比较分析，总结基因分型及耐药位点分布情况。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年11月至2015年6月本院门诊及住院部申请进行HBV基因分型和耐药突变基因检测的乙型肝炎患者共300例，其中男208例,中位年龄58.56岁；女92例，中位年龄59.25岁。

1.2 仪器与试剂 全自动荧光聚合酶链反应扩增仪(LightCycler 480)由罗氏公司提供，相关试剂盒由亚能生物技术(深圳)有限公司提供。

1.3 方法 HBV-DNA提取采用离心柱法，HBV分型和耐药突变基因检测采用聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法。检测具体方法及判断标准均严格按照试剂盒说明进行。使用亚能试剂对HBV 4种核苷(酸)类药物的耐药突变位点(野生型:rt250M、rt180L、rt202S、rt204M、rt207M、rt184T、rt207V、rt181A、rt236N;突变型:rt250V、rt180M、rt184S、rt184A、rt184L、rt184F、rt184I、rt204V、rt202G、rt202I、rt204I、rt207I、rt250I、rt250L、rt181V、rt236T)进行检测。

1.4 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HBV基因型检出情况 300例乙型肝炎患者中,检出HBV型别者有114例,检出率为38.00%。东营地区HBV感染者基因型有B型(13例)、C型(99例)、B/C型(2例)及其他未检测出的基因型(11例)，而无D型分型。检出型别以C型为主(81.8%)，11例未检出基因型别中，7例检出突变型位点，4例检出野生型位点。

2.2 HBV感染者核苷(酸)类药物耐药性分布 300例HBV感染者中，耐药性检测呈阳性的患者有55例，占总感染人数的18.33%。东营地区HBV患者耐药药物主要为拉米夫定(LAM)和替比夫定(LDT)的联合耐药，占43.6%。其次为LAM、LDT和恩替卡韦(ETV)的联合耐药，占23.6%。出现LAM和阿德福韦酷(ADV)单项耐药的比例较小，分别为5.6%和3.6%。见表1。

2.3 HBV基因型与耐药突变位点关系 HBV患者所有分型中耐药阳性中耐药突变位点突变型主要为rt204I(24.35%)，rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%)。见表2。

注:检出率为单个突变位点检出次数/所有突变位点检出次数×100%。

2.4 HBV基因型与核苷(酸)类药物耐药的关系 B型中耐药有4例,耐药率为30.77%,其中ADV单项耐药有1例,LAM、LDT和ETV三重耐药2例，LAM、ADV、ETV和LDT四重耐药1例。C型中耐药有42例,耐药率为42.42%,其中LAM单项耐药有3例,ADV单项耐药的有1例，LAM和ETV联合耐药1例,LAM和LDT联合耐药20例，LAM、LDT和ETV三重耐药8例，LAM、LDT和ADV三重耐药9例。B/C混合型中耐药2例,耐药率为100.00%,其中LAM和LDT联合耐药有1例，LAM、ADV、ETV和LDT四重耐药1例。其

他基因型中耐药7例，耐药率为63.64%，LAM和LDT联合耐药3例，LAM和ETV联合耐药1例,LAM、LDT和ETV三重耐药3例。C型耐药率高于B型,差异有统计学意义(χ2=9.694,P<0.05),D型、B/C混合型等因例数较少,未进行统计分析。

3 讨 论

PCR-反向点杂交技术是Okamoto等[4]于1989年提出的，是采用PCR体外扩增和DNA反向点杂交相结合的DNA芯片技术[5]。该方法将多种核酸检测探针固定在膜条上，通过与扩增后的待检靶序列杂交，一次即可进行多种基因亚型的分类，这项技术不仅能检测HBV基因型,同时也能检测多个HBV耐药突变位点，因此具有很高的检测效率，而且简单、经济[6]。在耐药突变方面,其针对LAM、ADV、ETV和LDT 4种核苷(酸)类药物常见的8种耐药位点的野生型和突变型共25种耐药模式设计特异性探针。本试验使用亚能生物技术公司相关试剂进行试验，并对其结果进行总结分析。HBV基因的复制通过反转录途径进行，由于其反转录酶缺乏矫正功能，HBV基因复制过程中会产生自然变异。而在这种变异的不断积累下，HBV基因组核苷酸序列产生了巨大的变化,形成了HBV基因组的差异。

目前国内批准用于治疗乙型肝炎的核苷(酸)类药物有LAM、ADV、ETV和LDT等4种。抗病毒治疗的目标是过抑制病毒复制[7]，最终阻止或延缓慢性HBV感染所导致的并发症，停止或逆转肝损伤、肝硬化或肝癌、肝纤维化的进展。由于持久性的共价闭合环DNA(cccDNA)的存在和病毒整合到受感染的肝细胞的细胞核基因组中，HBV感染的根除是不可行的[8]。在初始治疗中，首选抗病毒作用强大，耐药基因屏障高且耐药发生率较低的单药，或者联合使用2种以

上无交叉耐药的药物[9]。而这些药物的长期应用可引起病毒耐药突变是导致临床抗病毒治疗失败的原因之一[10]。本研究结果显示，东营地区300例乙型肝炎患者中耐药突变阳性患者有55例，其中以LAM和LDT的联合耐药为主(43.6%)；出现两重耐药的比例为47.2%;出现三重耐药的比例高达40.0%；出现四重耐药的比例低，为3.6%。LAM和LDT联合耐药比例较高，与这两种药物临床使用率高且应用时间较长有关，也可能与ETV耐药有关，因为ETV耐药会带有LAM和LDT的耐药位点。从表1可以看出，ADV和ETV总的耐药率分别为23.6%(3.6%+3.6%+16.4%)和30.8%(3.6%+3.6%+23.6%)，所以ADV和ETV可以作为东营地区慢性乙型肝炎抗病毒治疗的一线药物。

本研究中发现，东营地区出现的耐药突变位点主要为rt204I(24.35%)，其次为rt204V(17.39%)和rt180M(17.39%)。204位点的变异发生在活性高且高度保守的HBV聚合酶C区YMDD位点上，YMDD基因序列直接参与HBV聚合酶的催化反应，单一位点的变异即可造成对LAM或LDT的耐药，这也造成了本地区LAM和LDT的高耐药率。rt180M是乙型肝炎患者204位点变异后如果继续服用LAM或LDT，使病毒再增加的变异位点,这将大大降低这两种药的抗病毒效果[11]，如果rt204I/V和rt180M突变位点同时出现，那临床上应避开这两种药的选择。

通过耐药突变基因位点的检测,可以了解不同基因型的耐药表型,对指导乙型肝炎患者的抗病毒治疗有重要作用。HBV有A、B、C、D、E、F、G、H、I等9种不同的基因型，我国以“南B北C”的情况为主[12-13]。本研究对HBV感染者基因型分型，结果显示东营地区乙型肝炎分型有B型、C型、B/C型及其他未检测出的基因型，而无D型；C型为主要检出基因型，反映了北方地区的