5'-核苷酸酶检测标准操作规程
1、目的
用于体外定量检测人血清中5'-核苷酸酶的含量。
2、适用范围：所有工作人员。 3、方法原理
方法：连续监测法
原理：5'-NT水解次黄苷-5'-单磷酸盐（5'-IMP），生成次黄苷，在嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）存在下， 后者转化为次黄嘌呤，继而经黄嘌呤氧化酶（XOD）作用，次黄嘌呤转化为尿酸和H2O2，在过氧化物酶（POD）存在下H2O2与N-乙基-N-（2-羟基-3-磺丙基）-3-甲基苯胺（EHSPT）和4-氨基安替比林（4-AAP）反应生成有色醌，在550 nm处连续监测有色醌的生成速率，计算出5'-NT活性。 次黄苷-5'-单磷酸盐＋H2O 5'-NT 次黄苷 ＋磷酸 次黄苷 ＋磷酸 PNP 次黄嘌呤＋核糖-1-磷酸 次黄嘌呤＋2H2O＋2O2 XOD 尿酸＋2H2O2
2H2O2 ＋ 4-AAP ＋EHSPT 4H2O＋有色醌
单位定义：在37℃条件下催化底物生成1μmol次黄苷的酶量，为1个5'-NT活性单位。
POD
4、试剂
4.1试剂厂家及规格
试剂厂家： 试剂规格： 4.2储存条件及有效期
2～8℃避光保存，自生产日期起可稳定12个月。 试剂开封后，在2～8℃冷藏，避光条件下可稳定20天有效。
5、使用仪器
奥林巴斯AU400。
6、标本
6.1标本的采集、处理及储存
常规静脉采集约2ml置于含分离胶的采血试管内，做统一且唯一标识，30min内离心备用。室温（15-25℃）稳定一周，2-8℃稳定一个月，对于保存时间超过1个小时的血清为避免标本水分挥发使血清浓缩需加塞密封。 6.2标本的运输
常温下避光保存运输。 6.3标本的拒收标准
1）严重溶血、脂血、细菌污染的标本； 2）没有对应标识的标本； 3）非避光保存运输的标本；
4）其他如标识涂改、试管破裂的标本.
7、操作步骤
7.1基本参数设定： 分析方法 主波长 辅助波长 反应温度 读数时间 反应方向 速率法 505 nm 660 nm 37℃ 2min + 血清+R1反应时间 血清+R1+R2延迟时间 标 本 量 试剂R1量 试剂R2量 5 min 3 min 5 μl 210 μl 70 μl
7.2测定方法：
试剂R1（μl） 标 本（μl） 标准液 （μl） 蒸馏水 （μl） 试剂R2（μl）
测定管 210 5 --- --- 70
标准管 210 --- 5 --- 70
空白管 210 --- --- 5 70
混匀，置37℃孵育5分钟
混匀，置37℃孵育3分钟后读取各管吸光度，每隔1分钟读1次，共读2分钟，并计算平均每分钟吸光度变化率ΔA/分。
A样品－A空白 5'-NT含量（U/L）= A 标准 － A 空白 ×标准浓度 8、参考值范围
血清：0～11 U/L（37℃） 9、检验结果分析
如检验结果出现偏差，有以下几种可能原因及解决办法：
1、测定结果超出试剂线性范围，请稀释后测定，最后结果乘以稀释倍数； 2、更换试剂批号未定标或长时间未定标，请重新定标以校正检验结果； 3、标本严重溶血、黄疸或脂血会影响检验结果，请使用正常标本测定。 10、临床意义
5'-核苷酸酶是一种特殊的磷酸酯水解酶，能特异地水解5'-核苷酸，分布于肝脏和各组织中。5'-NT活性检测是对肝胆系统疾病检测灵敏度很高的一种方法。该酶在肝胆系统疾病时活性升高，骨骼系统疾病时不升高。
11、产品性能指标
1、试剂外观：R1为微红色透明液体，R2为无色透明液体，无浑浊、无沉淀。 2、试剂空白吸光度：空白吸光度＜0.3A。 3、试剂空白吸光度变化率：△A＜0.1A。 4、准确度：相对偏差应在±10%内。
5、测量精密度：重复性CV≤5%；批间差R≤10%。 6、分析灵敏度：△A/C＞0.01A/100U/L/min。
7、线性范围：0.39-200U/L，相关系数r≥0.9900，线性偏差R≤10%。 12、注意事项
1、R1含叠氮化钠（NaN3），避免摄入，避免接触皮肤或粘膜。如溅入眼睛或不慎摄入，应立即求医；如触及皮肤，应用大量清水冲洗；NaN3可与铅、铜形成可爆炸的叠氮化合物，废液倾弃时应用大量的清水冲洗，防止叠氮化合物堆积；如NaN3接触金属表面，应用10% NaOH擦净； 2、试剂和样本可因仪器要求不同，按比例增减。
7.3结果计算：
5-NT检测试剂盒操作规程
