院(系、部) 化学与生物工程学院 专业 生物技术（师范） 年级13级 学号17130208 姓名 组别 第二组 课程名称 植物细胞工程学 实验日期 2016.3-6 指导老师 实验名称 植物组织培养综合实验 一、实验目的
1. 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法
2. 学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；
3. 掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法； 4. 了解组织培养的基本程序；
5. 掌握接种的方法和材料的培养过程；
6. 掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术； 7. 观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体； 8. 了解MS培养基和1/2MS培养基的区别 二、实验原理
1. 植物细胞的全能性
一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。 2. 植物细胞表现出全能性的条件
1. 离体状态；
2. 有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）； 3. 选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型 3. 无菌条件
把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。 4. 脱分化与愈伤组织
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。 5. 培养基
植物组织培养常用的培养基为MS培养基。常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后(40℃以下)即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量一般在4—10克／升之间。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。这类培养基是目前使用最广泛的培养基。 6. 生长调节物质
包括天然植物激素额人工激素类似物。植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分
化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。
1) 生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细
胞分裂，有利于形成愈伤组织。同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚丁酸（IBA）等。在使用2，4-D时，必须严格控制使用浓度和培养时期，因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养时不能使用2，4-D代替其他生长素。
2) 细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增
强蛋白质合成等。此外，它还能显著改善其他激素。离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）等。
3) 赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素
有20多种。自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。在离体培养条件下，赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1. 植物材料：马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯菊、金叶女贞、
黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季） 2. 实验药品（试剂）：甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精
（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；
3. 仪器设备和实验用具：高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、
镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。
四、实验步骤
(一) 培养基母液的配制(2016/3/4)
贮备液III(mg) (100×) 3.70 16.50 4.40 19.00 1.70 8.3 62 223 100mL 500mL FeSO4·7H2O Na2EDTA·2H2O 生长调节剂 6-BA NAA 肌醇 烟酸 盐酸硫胺素 50mg 50mg 1000 5 1 100mL 50mL 278 373 100mL 1. MS培养基贮备液配制 贮备液I(g)(20×) MgSO4·7H2O NH4NO3 CaCl2·2H2O KNO3 KH2PO4 KI H3BO3 MnSO4·4H2O 贮备液II(mg) )(100×) 贮备液IV(mg) )(100×) ZnSO4·7H2O Na2MoO4·2H2O CuSO4·5H2O CoCl2·6H2O 86 2.5 0. 25 0. 25 盐酸吡哆醇 甘氨酸 5 20 称量 溶解 混合 定容 表1
1) 每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再
将它们混溶，定容。
2) 贮备液III需加热溶解。混合后调至pH5.5，定容，保存在棕色玻璃瓶内。 3) 6-BA：1 mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。
NAA：1 mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。
4) 各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍
数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。
2. 其他试剂的配置
1) 1 mol/L 的NaOH：1瓶 2) 1 mol/LHCL ：1瓶
3) 0.1%的升汞或2%次氯酸钠：每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min) 4) 70~75%酒精：每个超净工作台一瓶 5) 95%酒精：每个超净工作台一瓶 6) 75%酒精棉球：每个超净工作台一瓶
(二) 培养基的配制与灭菌
1. 培养基配制
1) 配制培养液（MS培养液）：按每次配制500 mL培养基计，用量筒或者移
液管从各种母液中分别取出贮备液I 25 mL、贮备液II、Ⅲ、Ⅳ各5 mL； 2) 溶化琼脂：用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500 mL搪瓷缸中，
加入蒸馏水400 mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至500 mL，搅拌均匀。
3) 调pH：用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶
化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。
4) 培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧
杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。组培瓶中培养基的量约50 mL 。每500 mL培养基，可分装10～15瓶。
5) 培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。最后在组培瓶外壁贴上标签。 2. 培养基灭菌（高压灭菌）
1) 放培养瓶。将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭
菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。 2) 放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅
内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物
品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
3) 待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 ℃下，灭菌20
min。灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。
3. 其他灭菌
1) 不耐热的物质将采用过滤灭菌
如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。 过滤灭菌的原理：溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。
2) 玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌
即利用烘箱加热到160-180℃ 的温度来杀灭微生物。 3) 用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
(三) 接种室和超净工作台的灭菌处理
1. 接种室熏蒸灭菌
长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。
甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗)，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2小时进行。
对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸 2. 准备组培室
将组培室打扫干净，调至适宜温度 3. 超净工作台处理
1) 材料准备
用75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等 2) 灭菌处理
实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射20min-30min。关闭紫外灯，开启风机10min后打开日光灯。用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。
注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。
(四) 无菌苗的培养(2016/3/11)
1. 培养基配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌） 种子的萌发采用1/2MS培养基
1/2MS培养基 贮备液Ⅰ 12.5mL 贮备液Ⅱ 2.5mL 贮备液Ⅲ 2.5mL 贮备液Ⅳ 2.5mL 蔗糖 15g 琼脂 5g 2. 马齿苋（番茄）种子处理
1) 洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗30min
后倒掉水备用；
2) 将种子置于培养瓶中，用75%酒精消毒灭菌30~60s，用无菌水冲洗干净； 3) 用1%升汞处理8~10min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，
置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。
3. 接种及培养
1) 用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌；
2) 打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）将
培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。 3) 培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上进
行培养，条件为2000-3000LX，26±1℃，培养一周。
实验结果：所有马齿苋无菌苗均染菌（未拍照） 实验分析：①马齿苋种子消毒、灭菌时间不足
②接种室和培养实灭菌不彻底，环境较脏 ③实验操作不正确 ④超净工作台不干净
(五) 愈伤组织诱导(2016/3/25)
1. 培养基的配制（方法同（二）培养基的配制与灭菌）
愈伤组织诱导培养基
组别 一 二 三 四 6-BA 0.5% 0.5% 0.5% 1% NNA 0.5% 1% 0.5% 1% 贮备液Ⅰ 25mL 贮备液Ⅱ 5mL 贮备液Ⅲ 5mL 贮备液Ⅳ 5mL 蔗糖 15g 琼脂 5g 2. 无菌苗和外植体的处理
1) 无菌苗处理
从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成0.5cm大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用； 2) 外植体处理
a 将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；
b 将洗净植物切去叶柄，将叶片从叶脉处剪开，再切成3～4 mm2的小
植物组织培养实验报告
