蛋白核小球藻多糖的酶解辅助提取及抗氧化活性

蛋白核小球藻多糖的酶解辅助提取及抗氧化活性

陈艺煊，刘晓艳，吴林秀，罗虹建，刘 斌*

【摘 要】摘 要： 利用纤维素酶对蛋白核小球藻多糖进行辅助提取，并在单因素的基础上，通过响应面试验对提取时间、提取温度、料液比和酶浓度等4个因素进行优化。结果表明：酶法辅助提取蛋白核小球藻多糖的最佳条件为：提取时间为2 h、提取温度为93℃、料液比为1∶30和酶浓度为2%，在该条件下多糖提取率可达6.13%，实际为(5.87±0.24)%。同时研究其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基的清除能力，结果表明蛋白核小球藻多糖能有效清除超氧阴离子自由基及羟基自由基。 【期刊名称】福建农业学报 【年(卷),期】2016(031)005 【总页数】7

【关键词】 蛋白核小球藻；多糖；纤维素酶；响应面；抗氧化 【文献来源】

https://www.zhangqiaokeyan.com/academic-journal-cn_fujian-journal-agricultural-

sciences_thesis/020121353943.html

蛋白核小球藻是一种普生性球形单细胞藻类，生态分布极广，在淡水、海水中均有发现[1]。随着蛋白核小球藻的价值逐渐被认识，日本、美国、苏联等国家将蛋白核小球藻开发为单细胞蛋白；20世纪80年代日本又以蛋白核小球藻开发出了保健、美容系列产品[2]，我国也于2013年将蛋白核小球藻列为新资源食品[3]。

蛋白核小球藻ChlorellaPyrenoidosa分布广、生长快,含有碳水化合物、蛋白质、油脂等营养成分，具有广阔的市场前景，但经热水浸提大部分是游离氨基

酸或者是变性蛋白质，而多糖耐热性好，易于提取，有利于高附加值的蛋白核小球藻开发[4-5]。小球藻多糖属于植物多糖，是小球藻的主要生物活性成分。研究表明，小球藻多糖具有调节机体免疫[6-7]、抗癌[8]、抗肿瘤[9]、抗病毒、抑菌[10]和抗氧化[11]等多种生物学活性。多糖的提取一般采用热水抽提法，但蛋白核小球藻细胞壁坚固[12]，难以直接提取。目前对微藻细胞的破壁方法主要有反复冻融法、超声波法、微波、酶解法、液氮研磨法等以及各方法的联用，目前实验研究处于很小规模，要用于大规模生产，还需要解决有关工程设备放大问题[13-18]。而酶解法能有效破除细胞壁，降解纤维素，使多糖从细胞中溶解出来，且作用条件温和、效率高，因此利用纤维素酶辅助提取蛋白核小球藻多糖，为蛋白核小球藻多糖的保健品及药物等的开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

原料：蛋白核小球藻，中国科学院野生生物种质库；试剂：葡萄糖、硫酸、苯酚、无水乙醇，均为国产分析纯；纤维素酶(活力>15 000 U·g-1，国药集团化学试剂有限公司)；设备：电热恒温水浴锅(DK-S24)，上海精宏实验设备有限公司；电子天平(AL204)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；循环水式多用真空泵(SHB-Ⅱ)，郑州长城科工贸有限公司；旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；紫外分光光度计(TU-1810),北京析通用仪器有限公司；低速台式离心机(TDL-S-A)上海安亭科学仪器厂。 1.2 蛋白核小球藻多糖的提取工艺

准确称取一定量蛋白核小球藻→加适量蒸馏水→调pH至4→酶解30min→灭酶→热水浸提→离心(4 500 r·min-1,10 mim)→上清液真空浓缩至原体积

1/5→3倍95%乙醇醇沉→4℃过夜→离心(4 500 r·min-1,10 mim)→沉淀冷冻干燥→蛋白核小球藻多糖。 1.3 多糖含量测定[19]

1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 精密称取 105℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖 0.010 00 g置于 100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度摇匀，即配得 0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准储备溶液备用。分别取事先配好的0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液0、100、200、300、400、500、600、700 μL于具塞试管中，并用蒸馏水补足至1 mL，摇匀，先后迅速加5%苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL。静置10 min后，放入40℃水浴锅反应15 min，以蒸馏水为空白对照，于490 nm处测量吸光值，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。得到线性回归方程为:Y=8.37X-0.083,R2=0.991 5。

1.3.2 单因素试验 准确称取样品2.0 g, 置于100 mL锥形瓶中，以提取时间(1、2、3、4、5 h)、提取温度(20、40、60、80、100℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)和酶质量浓度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，W/V)为单因素进行提取优化，获得蛋白核小球藻多糖后，复溶，并稀释至适宜浓度，利用苯酚-硫酸法进行多糖含量的测定，根据葡萄糖标准曲线，计算多糖提取率。每个试验做3个平行。

多糖提取率R1/%=[C*V/M]×100%，其中C为多糖质量浓度/(mg·mL-1)，V为反应液体积/mL，M为原料质量/mg。

1.3.3 Box-Behnken 试验 为了进一步优化多糖提取条件，根据单因素试验结果，以提取时间、提取温度、料液比和酶浓度为自变量，以多糖得率为响应值设计Box-Behnken试验。试验各因素与水平见表1。