人源性角蛋白的提取以及小分子HHK肽蛋白生物活性
摘要】 生物材料角蛋白（HHK）可诱导损伤组织细胞的再生，引起细胞生长分化状态的变化，是具有组织相容性的优良天然生物材料。本研究通过化学法提取HHK，超声波处理HHK水溶液，制得小分子量肽蛋白，MALDI-TOF-MS检测HHK分子量范围，体外MTT检测研究HHK小分子肽蛋白对细胞增殖的影响，流式细胞术检测HKK对细胞周期的影响。结果证明，分子量小于1500Da的HHK蛋白肽段对细胞增殖影响具有浓度依赖特性，对细胞增殖影响最大的HHK肽段浓度为10mg/mL，细胞周期受HHK添加浓度影响。说明HHK分子中蛋白序列具有特异的诱导调控细胞增殖分化的生物活性。
【关键词】 生物医用材料 角蛋白 MTT MALDI-TOF-MS 引言：
诱导组织再生生物材料的诱导性能可能源于材料空间三维结构，材料分子结构中具有组织细胞特异识别片段，以及生物材料中含有核酸片段三个方面。人发角蛋白（Human hair keratin, HHK），是一种具有优良材料学性能，生物相容性，无免疫原性，可降解的天然生物材料[1]，可经过机械法[2，3]，化学法[4]，生物法[5]，提取。提取的角蛋白粉末通过添加交联剂戊二醛[6]，或采用模压方法等可以制成力学性能优良的生物医用材料，并可作为组织工程用细胞生长支架。角蛋白材料与其他组织植入材料相比，具有优良的诱导组织再生能力，受损组织修复时间缩短，组织生理功能恢复良好。其中角蛋白制成的人工腱[7]已用于临床，取得了较理想的效果，用于修复脊髓损伤[8]，真皮缺损[9]，角蛋白纤维桥接周围神经缺损[10]等，均取得了预期良好的效果。Parry[11]发现角蛋白的一级氨基酸序列由两种基本的五肽环重复单元构成，分别为重复单元A(C-C-X-P-X)和B(C-C-X-S/T-S/T),这里C代表半胱氨酸(Cys),P代表脯氨酸(Pro),S代表丝氨酸(Ser),T代表苏氨酸(Thr),X代表除这几种之外的构成蛋白质的任何一种氨基酸。在第一种重复单元A中又衍生出两种新的重复结构单元C-C-Q-P-X(A1)和C-C-R-P-X(A2)。这些重复单元相互作用构成重复单元组合。不同的提取方法会得到分子量不同的HKK片断，处理时间越长，处理条件越苛刻，所得HKK分子量越小，溶解率越高。本研究通过化学法提取HKK，超声波处理HKK水溶液，得到分子量小于1500Da的肽蛋白，通过体外MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期变化，初步验证小分子肽蛋白对细胞增殖分化的影响。结果证明小分子肽蛋白对实验用三种细胞增殖能力，细胞周期均有影响，证明了组织诱导性生物材料分子组成可调控细胞生长分化。
1 实验仪器和材料
1.1实验仪器：RayTo RT-600酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）； Five Easy实验室pH计（梅特勒托利多）；电子天平PL203（梅特勒托利多）；冷冻干燥机（LGJ-18C）；TGL-16B高速台式离心机4800 Plus MALDI TOF/TOFTM美国ABI公司，贝克曼EPICS XL-MCL ADC 流式细胞仪，细胞周期拟和软件ModFit。 XSZ-D2倒置光学显微镜（重庆光学仪器厂）；JY92-IIN超声波细胞破碎机(宁波新艺超声设备有限公司)；超净台（北京文慧天创洁净有限公司）。
1.2实验材料及试剂：人发粉末（人发理发店随机取样），Hela细胞，Shg-44神经胶质瘤细胞，3T3成纤维细胞由实验室提供。β-巯基乙醇（AR 北京化学试剂厂）；十二烷基磺酸钠（SDS）（AR 北京化学试剂厂）；尿素（AR 北京化学试剂厂）；噻唑蓝(MTT)购自Sigma 公司；溴化乙锭（PI）购自Sigma 公司；RNase A
购自Sigma 公司；Triton X-100（AR 北京化学试剂厂）。 2 实验方法
2.1水溶性角蛋白提取
参考文献所述方法[12]，β-巯基乙醇用三蒸水稀释至3%，加入尿素，使得尿素浓度达到7mol/L，加入SDS，使W（SDS）=2%，配置成还原性溶液。人发粉末称重H，以1：100浸泡于还原溶液中，45℃反应12h。反应完成后，室温冷却，离心取上清。上清收集，倒入截流分子量为12-24Kb的透析袋中，透析36小时。所得角蛋白溶液冷冻干燥24小时后得絮状白色角蛋白粉末。所得角蛋白粉末按溶于纯水中分别配制成0.1g/ml，0.01g/ml，0.001g/ml，0.1mg/ml角蛋白溶液，冰浴条件下超声波处理5分钟，功率 600w，超声7s，间歇8s，得到透明澄清角蛋白溶液，-20℃冻存后置于4℃保存过夜，得到结晶（图一）。 2.2 MALDI-TOF-MS检测角蛋白分子量范围
0.01g/ml角蛋白HiPrep Desalting Column（预装Sephadex G-25 Superfine填
料 Millipore公司）除盐，与基质以1：1混合，室温下干燥，MALDI-TOF-MS检测，选择分子量检测范围500-1500Da。
2.3 MTT法检测角蛋白对Hela细胞，Shg-44神经胶质瘤细胞，3T3成纤维细胞增殖的影响
角蛋白诱导细胞增殖能力采用MTT法检测。细胞接种于96孔组织培养板中，待细胞生长密度至50%时，血清饥饿培养24小时。角蛋白冻干粉溶解于小牛血清中(FBS, 杭州四季青公司 CA)浓度为100mg/mL到0.1mg/mL，过滤除菌。细胞在含有角蛋白的培养基中培养，等到细胞生长至90%的汇合度，MTT检测。吸光度读数采用RayTo RT-600酶标分析仪，测量细胞相对数量。 2.4 流式细胞仪检测角蛋白对细胞周期的影响
取对数生长期的hela细胞按1X106/mL以2mL体积接种于6孔板内，加入角蛋白溶液，24小时后终止培养，消化贴壁细胞，总细胞数在1X106以上。1000g离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜。1000g离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A, 0.2% Triton X-100, 4℃避光孵育30分钟。流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。 2.5统计学方法
应用SPSS for windows Release 17.0标准版统计学软件包进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），显著意义采用t-test检验。 3 实验结果
3.1 角蛋白提取制备
化学法处理角蛋白，通过还原剂β-巯基乙醇打开二级结构中的二硫键，得到含有大量巯基的角蛋白，SDS作为巯基保护剂，尿素作为蛋白稳定及。45℃反应12h，透析，冷冻干燥后得到白色絮状角蛋白粉末，该蛋白粉末分子量范围45-60KDa。0.1g/ml 角蛋白溶于三蒸水，超声波处理5min后-20℃放置1小时，置于4℃溶解, XSZ-D2倒置光学显微镜得到不等边三角形结晶及其聚合物（图1）。角蛋白分子一级蛋白序列由五肽重复构成[11]，成共嵌段结构，该结构使角蛋白具有超分子自组装性能，与水分子结合形成晶体结构。
。
图1 溶液中角蛋白结晶(300×)
3.2 MALDI-TOF-MS检测角蛋白分子量范围
分子量小于600Da含有基质干扰峰，在500-1500Da分子量范围内，样品峰（图2）与空白基质峰（图3）部分重叠。空白基质中568.08为丰度最高的物质峰。说明样品峰中568.17的物质峰为基质峰。样品峰中丰度高于基质峰的物质峰均为样品混合物峰图，分别为
514.07 522.20 544.20。HHK样品MS图谱中分子量 600Da的物质峰按依各分子量范围丰度从高到低排列分别为660.05 622.08 676.03 522.21 644.07 666.06 756.21 735.07 865.07 887.07 903.04。500-60KDa MALDI-TOF-MS图谱检测得到618.4085 672.6706 860.5637 915.0673 四个分子量范围。
使用生物材料的一个主要原因是提供给细胞生长，黏附的替代性ECM。通过细胞表面受体，与ECM特定位点结合，对于控制细胞正常功能形态具有重要作用[13-16]。细胞通过20多种已知的整合素受体与ECM表面特殊位点结合，这些位点通常是arg-gly-asp(RGD)肽段[14]。通过检测已知的70多种人类角蛋白蛋白序列发现70%的角蛋白至少含有一个上述整合素特异识别肽段，23%的角蛋白含有两个以上该类位点[17]。 。
图2 MALDI-TOF-MS HHK 500-1500Da检测分子量范围
。
图3 MALDI-TOF-MS 500-1500Da空白基质谱图 。
图4 HKK MALDI-TOF-MS 500-60000Da分子量图谱
3.3 MTT法检测角蛋白对Hela细胞，Shg-44神经胶质瘤细胞，3T3成纤维细胞增殖的影响
体外MTT细胞实验评价不同浓度HHK溶液对细胞（Hela，3T3真皮成纤维细胞，Shg-44神经胶质瘤细胞）增殖影响，角蛋白稀释后添加入培养基，细胞培养24小时。对照实验组为添加FBS培养基培养。（图5-7）细胞增殖检测显示了剂量依赖性，即出现最佳添加浓度（10mg/mL)。在正常头发生长过程中，细胞受到刺激与抑制双重控制，说明在该材料含有对细胞生长具有调控作用的物质。在较高剂量下，有抑制细胞生长的调控分子。当角蛋白浓度降至10mg/mL时，统计数据表明与对照组相比，实验组有显著性差异。（P<0.05，n=6） 。
图5 MTT法检测角蛋白溶液对Hela细胞增殖的影响。（n=6,*P<0.05） 。
图6 MTT法检测角蛋白溶液对3T3成纤维细胞增殖的影响(n=6,*P<0.05)
。
图7 MTT法检测角蛋白溶液对Sgh-44神经胶质瘤细胞增殖的影响(n=6,*P<0.05) 3.4 细胞周期分析
HHK浓度为100mg/mL的样品组G1/G0期比率高于空白对照组，HHK浓度为10mg/mL样品G1/G0期比率下降，S期细胞数比率均随样品浓度下降开始升高。 100mg/mL的样品组G2/M期细胞比率下降明显，凋亡细胞峰增大。高浓度HHK有诱导细胞凋亡趋势。细胞周期实验表明，HHK对细胞增殖调控具有浓度依赖性，高浓度抑制DNA合成，诱导细胞凋亡，低浓度诱导细胞进入细胞周期，促进细胞增殖分裂。
(a) 对照组（不加HHK组） (b) 添加 HHK 0.1g/mL (c) 添加 HHK 10mg/mL (d) 添加HHK1mg/mL培养36小时
。 (a)
。 （b） 。 （c） 。 （d）
图6 HHK诱导分化3T3成纤维细胞36小时细胞周期分布图 4 结论
HHK小分子蛋白肽氨基酸序列具有共嵌段结构，有自组装特性，可在4℃溶液状态下结晶（图1）。化学法提取后得到大分子量溶解性差的絮状角蛋白，通过超声波处理得到500-1500Da分子量范围内小分子肽段（图2、3、4）。这些小分子蛋白肽具有促进多种细胞增殖能力。这种对促进细胞生长增殖有特异性作用的原因是角蛋白基质上细胞黏附位点。大部分角蛋白一级结构含有RGD基序，或X-天冬氨酸-Y基序，其中X可以为甘氨酸，亮氨酸，谷氨酸。Y可以为丝氨酸或缬氨酸。这些普遍分布于角蛋白生物材料的基序，是细胞表面有关细胞黏附的整合素的特异性位点，促进细胞内信号途径的激活（图5，6，7）。角蛋白家族为细胞表面标志蛋白，在细胞分化不同阶段表达不同。小分子角蛋白肽段对细胞周期具有明显影响，高浓度HHK明显促进细胞停留在G1/G0期，有诱导细胞分化凋亡趋势，低浓度HHK促进细胞进入细胞周期。实验证明，HHK作为天然生物材料诱导组织细胞再生的主要调控作用可能为HHK一级氨基酸序列。天然生物医用材料保证其最佳生物功能可以通过确保一级结构最大限度保留来达到。 参 考 文 献
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人源性角蛋白的提取以及小分子HHK肽蛋白生物活性
