目的： 验证pGBKT7-A和pGADT7-B是否为相互作用的关系。
方法：将构建到pGBKT7载体上的A基因及构建到pGADT7的B基因，通过共转的方法转化至酵母菌株AH109。
材料：
1.诱饵克隆：pGBKT7-A 猎物克隆：pGADT7-B
2．载体：pGBKT7、pGADT7 3．Clontech酵母双杂交系统 4．培养基：
1). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：
SD-TL：-trp, -leu； SD-TLH：-trp, -leu, -his； SD-TLHA：-trp, -leu, -his, -ade。 3). 其他贮备液：
10 × TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10 × LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌；
第一部分将质粒转化受体菌AH109中 1.1酵母转化
将以下质粒分别转入AH109中： Reaction 1 2 3 4
pGADT7-B pGADT7-B pGADT7 pGADT7-largeT
pGBKT7-A pGBKT7 pGBKT7-A pGBKT7-p53
AD plasmid
BD plasmid
涂板种类 SD-TL SD-TL SD-TL SD-TL
实验组 对照组 对照组 阳性对照
5
pGADT7-largeT
pGBKT7-laminC
SD-TL
阴性对照
1.2 酵母转化方法
1.从YPDA平板挑取AH109单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。
2.转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6-0.8。
3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4.用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5.用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
备注
6.用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
7.每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
240 ul
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10.30℃水浴复苏，30 min。
11.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
12.每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
13.30℃恒温培养4天
1 M LiAc
36 ul
ssDNA mg/ml)
5 ul
(20
质粒DNA
各5 ul
1.3 检测结果
从实验组pGBKT7-A和pGADT7-B，对照组pGBKT7和pGADT7-B， pGBKT7-A和pGADT7，阳性对照pGADT7-largeT+pGBKT7-p53，阴性对照
pGADT7-largeT+pGBKT7-laminC共转AH109长出的酵母转化子随机各挑取了8个单菌落进行PCR检测并保菌。从PCR检测正确的单菌落中随机各挑取3个进行点板。
图4. 检测结果
pGADT7-LargeT+pGBKT7-p53（+）为阳性对照 pGADT7-LargeT+pGBKT7-LaminC（-）为阴性对照
阳性对照菌株在SD-TL、SD-TLH、SD-TLHA、SD-TLHA +x-α-gal缺陷平板上都能正常生长，并能在SD-TLHA +x-α-gal上显蓝色；阴性对照菌株在SD-TL能正常生长，在SD-TLH、SD-TLHA 、SD-TLHA +x-α-gal缺陷平板上不能生长。
实验组生长状况同阳性对照一致。 结论：pGBKT7-A和pGADT7-B互作。
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新-酵母双杂交一对一验证结题报告
