血液病患者鲍曼不动杆菌的耐药性分析及其耐药基因检测*
王秀凤1，陈祎霏2#，尹秀云1，闫中强3△，陈建魁1▲
【摘 要】摘 要:目的 了解血液病患者临床分离鲍曼不动杆菌的耐药表型和多种耐药基因的携带情况。方法 收集2011年临床分离的非重复鲍曼不动杆菌120株，采用纸片扩散法进行药敏试验，试验结果按照CLSI 2011年版标准判读，采用WHONET 5.6 软件进行数据分析；应用聚合酶链反应及测序方法检测10种耐药相关基因(blaOXA-51-like、 blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、 blaOXA-58-like、 blaTEM、 blaampC、 armA、 ISAba1、 intI 1和intI 2)。结果 鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的耐药率范围为48.3%～94.2%，对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为51.7%和48.3%；耐药相关基因blaOXA-51-like、 blaOXA-23-like、blaTEM、 blaampC、 armA、 ISAba1和intI 1的阳性率分别为100%、60.0%、46.7%、85.8%、75.8%、86.7%和85.0%，而未检出blaOXA-24-like、blaOXA-58-like和intI 2。结论 碳青霉烯类抗菌药物对鲍曼不动杆菌仍具有较好的体外抗菌活性，鲍曼不动杆菌多重耐药相关基因的携带率较高，多重耐药现象非常严重，应加强其耐药性监测，合理使用抗菌药物。 【期刊名称】国际检验医学杂志 【年(卷),期】2013(034)018 【总页数】3
【关键词】关键词:不动杆菌属; 抗药性,微生物； 聚合酶链反应
鲍曼不动杆菌是医院感染的重要条件致病菌，近年来引起的医院感染日益突出，其耐药性也越来越严重[1]。由于血液病及恶性肿瘤患者免疫力低下，属于鲍曼
不动杆菌院内感染的危险易感人群[2]。本研究收集了120株来自血液病住院患者的鲍曼不动杆菌临床分离株，对其耐药表型及耐药基因进行了检测分析，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验菌株 2011年1～12月期间收集120株不重复鲍曼不动杆菌，菌株的标本来源包括痰、尿、分泌物、血液、脑脊液等，所有标本均来自血液科、造血干细胞移植科的住院患者。
1.2 仪器与试剂 药敏试验纸片及M-H琼脂均为英国Oxoid公司产品，抗菌药物包括：亚胺培南(IMP)、哌拉西林(PRL)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、环丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)、复方磺胺甲恶唑(SXT)、美洛培南(MEM)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、头孢呋辛(CXM)。PCR实验所用的TaKaRa Ex Taq?(Code: DRR100A)和dNTP Mixture (TaKaRa Code: D4030A)均由宝生物工程(大连)有限公司提供；DNA标记物采用GeneRulerTM 100bp Ladder (Fermentas Lot: 00014461)。主要的仪器包括：Vitek II 全自动微生物分析仪(生物梅里埃公司)；VeritiTM PCR扩增仪；Tanon GIS-100013数码凝胶图像处理系统；K10CD干式恒温器(杭州蓝焰科技公司)；离心机(广州深华赛默飞世尔Thermo)。
1.3 细菌鉴定与药敏试验 细菌分离、培养、鉴定和药敏试验均严格按照《全国临床检验操作规程》(第三版)进行。所有菌株采用Vitek Ⅱ全自动微生物分析仪进行临床常规鉴定；采用K-B法(纸片扩散发)测定13种抗菌药物的敏感性，铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株，根据美国CLSI 2011年版标准进行敏
感性判断。
1.4 DNA模板的提取 用煮沸法制备DNA模板。将在MH平板上培养过夜的细菌菌落混悬于2 mL的8.5 g/L 的NaCl中，使成5个麦氏单位，12 000 r/min，离心2 min，沉淀重悬于200 uL无菌去离子水，并转移至无菌的1.5 mL EP管，置于K10CD干式恒温器10 min后，12 000 r/min，离心5 min，取上清液保存于-20 ℃，备用。
1.5 引物合成及PCR扩增 多种耐药基因引物设计参照文献[3-4](见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL TaKaRa Ex Taq 0.125 μL，10 μmol/L Primer Mix 1 μL，2 ng/μL 模板DNA 5 μL，用去离子水补足至25 μL。多种耐药基因PCR 扩增条件参照文献[3-4]进行，扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，EB 染色，在紫外灯上观察结果并用凝胶成像系统记录电泳结果，每次PCR 检测均设阴性对照。抽取3株相关耐药基因的阳性扩增产物并进行测序，结果在GenBank(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对分析。
2 结 果
2.1 鲍曼不动杆菌对13种抗菌药物的敏感率和耐药率 鲍曼不动杆菌对各种抗菌药物的耐药率和敏感率见表2。该菌对碳青霉烯类抗菌药物亚胺培南和美洛培南的耐药率分别为51.7%和48.3%；对抗菌药物的耐药率范围为48.3%～94.2%。
2.2 鲍曼不动杆菌多重耐药相关基因谱的分布 单一PCR扩增产物的电泳结果见图1。blaOXA-51-like在所有菌株中均为阳性，除了blaOXA-24-like、blaOXA-58-like和intI 2基因为阴性外，其余耐药相关基因均有阳性扩增产物，
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