生物制品生物活性/效价测定方法验证指导原则
一、前言
对药品质量控制分析方法进行验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求。生物制品质量控制中生物活性/效价为反映生物制品有效性的关键质量属性，对相应的测定方法进行规范的验证是保障其适用性的前提。本指导原则从验证方案的制定、各验证指标的具体验证策略、验证结果的记录和方法的监控及再验证的角度阐述了生物活性/效价测定方法验证相关的要求，旨在对新建的或拟修订的生物制品生物活性/效价测定方法所开展的验证工作进行规范与指导。本指导原则中的生物活性/效价测定主要是指相对效价测定，该法系将供试品的生物反应与已知标准品产生的反应相比较，从而定量测定供试品相对于标准品的效价。
二、方法验证的基本要素
1. 验证方案
方法验证需根据验证方案来完成。验证方案不仅应包括验证设计、验证指标、合理的可接受标准和数据分析计划，还应涵盖不符合可接受标准时可采取的措施等。 1.1 验证设计
验证设计主要涉及样品的选择、实验变异来源的考量及试验重复策略等。应采用具有代表性的样品进行验证试验，并在验证方案中注明所需样品的类型及数量。实验变异的来源主要包括样品的制备、试验内和试验间的影响因素。试验内变异可能受方法开发阶段所确定的实验条件（温度、pH、孵育时间等）、实验设计（动物数量、稀释度组数、每个稀释组的重复数、稀释度间隔等）、试验过程、系统适用性和样品适用性要求、统计分析等因素的影响。而试验间变异主要受不同分析人员、不同试验时间、不同仪器设备和试剂批次等因素的影响。因此，一个设计良好的验证方案应综合考量试验内和试验间变异的来源。此外，每轮验证试验中标准品和供试品均应独立制备。验证中使用的重复策略应尽量反映影响效价测定结果的实验因素。 1.2 验证指标与可接受标准
由于相对效价测定方法各具特点，并随分析对象而变化，因此需视具体方法
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拟订具体的验证指标，关于常见验证指标的具体讨论见本节“2.各验证指标的验证策略”项下。应根据测定方法特点和验证目的来确定各验证指标的可接受标准。在评估某些验证指标是否符合可接受标准时，除了判定验证结果是否符合预设标准外，还可通过等效性检验方法判定验证结果的置信区间是否也符合要求。同时还应分别建立试验有效性的可接受标准（系统适用性要求）和样品结果有效性的可接受标准（样品适用性要求），上述标准可根据方法开发的情况制定，但最终需根据验证的数据进行修正并在验证完成前确定。 1.3 数据分析计划
应按照验证方案中列出的数据分析计划对验证结果进行分析，包括对验证指标结果的绘图和统计学分析，以及判断它们是否符合可接受标准等。常规的统计学方法一般要求数据之间相互独立，并呈近似正态分布和方差齐性。而测得的相对效价在多数情况下服从近似对数正态分布，因此，为满足上述统计学要求，通常采用相对效价的对数转换值进行数据分析，本指导原则中对数转换的底数可取任一适用的底数，一般以无理数 e 或 10 为底。当无法满足上述统计学要求时， 也可考虑采用其他适宜的替代方法进行数据分析。可在测定方法开发阶段通过对适量历史数据的分析而获知测得的相对效价的分布情况，若确定测得的相对效价为正态分布，则可直接采用测得值按下述统计方法进行数据处理，此时精密度一般用标准偏差（SD）或相对标准偏差（RSD，%）表示。
2. 各验证指标的验证策略
常见的验证指标包括专属性、相对准确度、精密度、线性和范围，后四个指标的验证通常可进行合并设计。 2. 1 专属性 2.1.1 定义
专属性系指在其它成分，如杂质、降解产物、基质等存在时，采用的测定方法不受这些成分的干扰能正确测定待测物的能力。专属性亦可指测定方法区分相关物质的能力，因此，对待测物中任何已存在的或新引入的相关物质均应加以研究。如方法专属性不强，应采用多种不同原理的方法予以补充。 2.1.2 评价方法
在杂质、降解产物或基质可获得的情况下，往平行稀释的标准品溶液中加入
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潜在的干扰物，并与未加干扰物的标准品溶液比较测得的相对效价的结果，采用合适的等效性检验方法考察二者剂量反应曲线的相似性和效价测得结果的一致性。也可取基质或与待测物结构相似的产品相关产物或非相关物质进行试验，基质、产品相关产物或非相关物质应均呈阴性反应。
在杂质、降解产物或基质不能获得的情况下，也可用强光照射、高温、高湿等方式对供试品进行加速破坏，以研究可能存在的降解产物和降解途径对相对效价测定的影响。 2.2 相对准确度 2.2.1 定义
系指在规定的范围内，测得的相对效价与真实值或参考值接近的程度，一般用相对偏差（RB，%）或其他适宜指标表示。 2.2.2 评价方法
在规定范围内，取标准品或已知效价的供试品稀释至不同的目标效价水平， 一般至少需要评估 3 个效价水平，但为了获得更可靠的结果，推荐评估 5 个效价 水平，每个效价水平分别至少独立测定 3 次。以效价理论值的对数（横坐标）对其相应的效价测定值的对数（纵坐标）作直线回归。采用每个效价水平测定值的相对偏差和不同效价水平相对偏差的变化趋势或其他适宜指标来评价相对准确度，其中相对偏差的变化趋势可用直线回归方程的斜率进行评价。
相对偏差计算公式如下：
效价测定值
RB = ( ? 1) ? 100%
效价理论值
在每个效价水平上，测得的相对效价的对数平均值的 100（1-2α）%（通常 取 α=0.05，即 90%）置信区间（CI），可按下式计算：
SD · CI = Average ± tdf √n 式中，Average 为每个效价水平效价测定值的对数平均值；
SD 为每个效价水平效价测定值的对数标准偏差； n 为每个效价水平效价测定值的个数； tdf 为自由度为 df 时的 t 界值表查表值；
df 为自由度，等于每个效价水平测定值个数减 1。
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《中国药典》2020版生物制品生物活性效价测定方法验证指导原则国家标准草案公示稿
