组织蛋白酶B抑制剂的药物研究
郝伟丽1 林洁2范玉玲2路新华2
（1.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016；2.华北制药集团新药研发有限责任公司，河北 石家庄 050015）
摘要：目的 对Cathepsin B（catB）抑制剂药物的研究概述。方法 以近年来国内外相关文献为依据，进行分
析归纳。结果与结论 catB是一个丰富而广泛表达的半胱氨酸蛋白酶，在许多生理和病理过程中发挥重要作用。进一步研究开发新的catB抑制剂药物，具有广阔发展前景。 关键词：组织蛋白酶B；抑制剂；半胱氨酸蛋白酶；抗癌药物
中图分类号：文献标志码：文章编号
Abstrat OBJECTIVE To investigate and summarize drugs of Cathepsin B（catB） inhibitors. METHODS By
analysis and summarization, according to the related literature domestic and abroad for the past few years. RESULTS AND CONCLUSION catB is an abundant and ubiquitously expressed cysteine proteinase, and plays very important roles in many physiological and pathological processes. It will take on a broad development perspective to research new drugs of catB inhibitors.
Key words Cathepsin B, inhibitors, cysteine peptidase, anticancer drugs
1. 前言
组织蛋白酶（Cathepsin，cat）是一大类主要存在于溶酶体的半胱氨酸蛋白水解酶，因催化中心不同而分为不同类型，组织蛋白酶B，C，K，L，M，N和S等属于半胱氨酸蛋白酶，组织蛋白酶A，G和R属于丝氨酸蛋白酶，组织蛋白酶D和E属于天冬氨酸蛋白酶[1]。
图 1 人类CB的X-射线结构图 Fig.1. X-ray structure of human catB
组织蛋白酶B（catB，EC 3.4.22.1）在肝、脾、肾、骨、神经细胞、间质成纤维细胞、巨噬细胞等都有分布，以酶原的形式贮存在溶酶体中。正常情况下，约10％的酶原被生理性
分泌至胞浆，被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，切除N端和C端多余的氨基酸残基形成活性形式，参与许多特殊的生理过程，如激素原的激活、抗原呈递、组织器官发育等。catB具有广谱蛋白水解酶活性[2]，水解位点为-Arg-Arg-/ -Xaa，在pH 3.0～7.0 都有活性，酸性条件下有外肽酶活性，中性pH下有内肽酶活性，碱性条件下会不可逆失活。
根据X-射线衍射结构图（图1），整个catB结构可分为L-，R-两个结构域[3]（图2），活性位点和底物结合位点位于这两个域的界面。底物在catB活性位点的插入，受18个残基组成的闭合环状结构控制。这个闭合环状结构也是catB区别于其他木瓜蛋白酶的特征，它提供了2个His残基，以结合到底物的C末端羧基上。闭合环形状是可变的，其稳定性与catB所处环境的pH有关。在溶酶体的酸性环境中，catB活性位点是闭合环状结构，catB为肽链外切酶，但当pH值升高，闭合环状结构被打开，而成为肽链内切酶。
图 2 底物插入到catB活性位点示意图
Fig.2. Schematic of the binding of a substrate to the active site of catB
2. catB 的病理功能
如上所述，catB具有双重蛋白水解活性，这使之能参与多种基底膜蛋白如层粘连蛋白，纤维连接蛋白，Ⅳ型胶原蛋白的降解，继而破坏一系列组织屏障，为癌细胞的移动打开通道，促进肿瘤细胞向深部组织浸润，参与肿瘤的发生和转移，并与肿瘤的复发有明显相关性[4]。肿瘤细胞可分泌catB，该分泌型的catB由于缺乏甘露糖-6-磷酸受体识别标记，故不能被摄入溶酶体，而多以酶原的形式存在于胞浆和细胞外[5]。由于肿瘤细胞能够酸化其周围的环境，其分泌的catB在此环境中活化，同时在中性及碱性环境中活性不受影响，甚至增高，因此癌组织匀浆中catB活性远高于远离癌肿的正常组织中catB的活性[6]，这可作为癌细胞恶性表型--浸润转移的一种指标。活化的catB除了自身参与胞外基质成分的降解外，还能激活蛋白水解级联反应，最终生成能够降解多种胞外基质成分的物质。
病理状态下，各种原因所致的细胞损伤(如病原微生物、炎症因子、氧化应激等)，导致溶酶体膜稳定性降低、通透性增高甚至破裂，大量catB释放到胞浆或组织间隙，并被激活，介导细胞炎症性坏死及发生凋亡，与人类许多疾病如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、Alzheimer病、多发性硬化症及其他急慢性炎症性疾病有关。因此抑制catB活性已成为相关疾病治疗的重要措施。
3. catB 抑制剂药物研究
因为高的catB活性是癌症发展的重要特征，因此使用catB抑制剂可以减少肿瘤转移和侵袭水平，这在许多体外实验中都得到了验证，动物实验证明选择性catB抑制剂可减少肝损害[7]
,也显示了其在肿瘤治疗中的潜力。 根据catB 抑制剂的来源，可将其分为内源性抑制剂、天然来源的抑制剂和合成抑制剂；还可根据抑制机制不同，分为可逆的抑制剂和不可逆的抑制剂。下面将分别描述。 3.1.1 内源性catB抑制剂
迄今为止，已经发现了大量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，形成一个超家族。其中最丰富和特征性的内源抑制剂可细分为4个家族，stefins，西司他汀类和激肽原这三者是真正意义上
的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，第四类家族在结构上与这个超家族具有一定的同源性，但不具备抑制半胱氨酸蛋白酶所必需的三个功能位点。所有的半胱氨酸酶抑制剂都是竞争的，可逆的，与底物紧密结合，抑制水平从mmol到pmol不等。 3.1.2 天然来源的catB抑制剂
从土壤生物中已经分离到三种自然来源的组织蛋白酶抑制剂，醛基肽、氮丙啶肽和环琥珀酸肽。这些抑制剂一半是非选择性的，因为木瓜蛋白酶家族有相似的三维结构，相似的底物特异性。
氮丙啶类抑制剂miraziridine[8]和醛类抑制剂的tokaramide A[9]，由海绵Theonella mirabilis中分离得到，对catB的IC50分别为1.4μg/mL，29ng/mL。许多潜在的醛类抑制剂也从strepiomyces菌株不同培养物中分离到，酶醛肽是其中最有潜力的catB抑制剂，IC50为9.2ng/mL[10]；从streptomyces spQ21705中分离到的YM-51804，对catB的IC50为12.0nM11]。最系统研究的poxysuccinyl肽类成员是从Aspergillus japonicus中分离得到E-64（图3），对catB，catL和木瓜蛋白酶的IC50分别为55nM，68nM和580nM[12]。
图 3 poxysuccinyl类抑制 Fig.3. poxysuccinyl inhibitors
黄酮类化合物也显示出很强的catB抑制活性。穗花杉双黄酮，4’-methylamentoflavone和 7’，4’-dimethylamentoflavone 可以从许多植物中分离得到，它们对catB的IC50低于mmol水平（图4）[13]。
图 4 天然来源的黄酮类catB抑制剂结构及其IC50
Fig.4. structure of the natural flavonoid catB inhibitor, with their inhibitory activities
从海绵动物体内的Asteropus simplex菌发酵产物中分离到一个新的蝶啶衍生物[14]，Asteropterin（图5），这是一个将2,4-二氧四氢蝶啶和N-甲基组胺连接在一起的独特分子，并具有catB 抑制活性，IC50为1.4μg/mL。
图 5 Asteropterin Fig.5. Asteropterin
从海洋Pseudomonas sp.PB01的发酵产物上清里分离到两种catB抑制剂[15]，邻苯甲二酸二丁酯和二-2-乙基己基苯二甲酸酯（图6），它们都是剂量依赖型catB抑制剂，IC50分别为0.42mM，0.38mM。
图 6 邻苯甲二酸二丁酯和二-2-乙基己基苯二甲酸酯结构 Fig.6. structrue of dibutyl phthalate and di-(2-ethylhexyl) phthalate
3.1.3 合成catB抑制剂
从微生物发酵产物中分离catB抑制剂作为潜在的抑制剂药物研究的先导化合物[9,16]，或者根据catB的巯基酶特性和特征性的闭合环状结构[17]来设计特异的catB抑制剂，是合成catB 抑制剂药物研究的切入点。此外，大分子抑制剂和catB之间形成的复合物的X射线晶体结构信息也可作为小分子化合物合成的依据[18]。 3.2.1 不可逆catB抑制剂
（1）环琥珀酸肽类catB抑制剂
此类化合物代是最广泛研究的catB抑制剂，代表性的是E-64[19]。在结构-活性研究中发
现，这些环氧环上的自由羧基取代物是此类化合物对半胱氨酸蛋白酶选择性的关键因素[20]，如果环上包含一个酯或酰胺取代物，同时C-末端有自由羰基取代物（可与His110和111残基反应），则可提高其对catB的选择性[21,22]。一系列环氧琥珀酰类的衍生物中，对catB选择性较高的是CA074 (图3)，与E-64及其衍生物不同，其SS构型是优于RR构型的。 （2）氮丙啶类catB抑制剂
图7 氮丙啶类catB抑制剂母核
Fig.7. parent structure of arizidine catB inhibitors
环琥珀酸衍生物的合成包含一个氮丙啶-2，3-双羧基作为亲电子基团，与catB Cys29反应。N端未取代的衍生物对catL的选择性更高[23]，而自由羧酸对氮丙啶环的攻击可以增强一系列N-端未取代的氮丙啶类化合物的活性[24,25]。此类抑制剂也可以在N端质子化，因此其抑制活性有极强的pH依赖性，在pH4.0的时候达到最大抑制效果。 （3）β内酰胺类catB抑制剂
图 8 β内酰胺类catB抑制剂 Fig.8. structure of β-Lactam catB inhibitors
β内酰胺核是抗生素和不可逆蛋白酶抑制剂的药效基团，虽然内酰胺类抑制剂对catB的选择性不高[26]，但是可以通过对其C3，C4位点的修饰使这类化合物成为catB选择性的新型抑制剂。
3.2.2可逆catB抑制剂
可逆的抑制剂可以降低毒性，在疗效方面极为重要。可逆的、紧密结合的catB抑制剂合成研究已经投入很多，但是只取得了有限的效果，因为对S和S’位点只能在一个方向上进行修饰而形成亲电子区域。 （1）醛类catB抑制剂
图 9 醛类catB抑制剂原理 Fig.9. principle of aldehyde catB inhibitors
NMR研究证明，醛类抑制剂可通过其醛基与丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的羟基形成四面体结构来抑制蛋白酶（图9）[27]。尽管醛和肽之间是共价结合，这类抑制剂仍然是可逆的抑制剂。过去的10多年里，已经合成了大量的醛类抑制剂，但极少有catB选择性的。最有catB抑制剂潜能的，是图10所示结构化合物[28]。
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