HPLC法测定龙须藤乙酸乙酯部位中4种黄酮类成分的含量

HPLC法测定龙须藤乙酸乙酯部位中4种黄酮类成分的含

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孙承韬 赖 昕 张 华 陈抒云 叶永华 徐 伟*

【摘 要】【摘 要】目的：建立HPLC测定龙须藤乙酸乙酯部位中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚含量的方法，考察不同产地龙须藤中4种黄酮类成分的含量。方法：Diamonsil C18 色谱柱(250×4.6 mm，5μm)，流动相乙腈(A)-0.1%的磷酸(B)，梯度洗脱(0 min，25 % A，75 % B；15 min，45 % A，55 % B；40 min，50 % A，50 % B)，流速为0.8 mL/min，检测波长为324 nm。结果：3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚进样量10 μL分别在0.5100～5.100 μg(r=0.9962)、0.1006～50.30 μg(r= 0.9998)、1.440～288.0 μg( r=0.9997)和0.2910～14.55 μg(r=0.9998)以上浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为99.48 %、99.32 %、98.99 %和98.75 %，RSD分别为0.40 %、0.62 %、0.50 %和0.44 %(n=6)。结论：该方法操作简单，稳定性、精密度、重复性良好，适合于测定该药材中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚含量的测定。 【期刊名称】中国民族民间医药 【年(卷),期】2017(026)009 【总页数】4

【关键词】【关键词】高效液相色谱；龙须藤；黄酮；含量测定

龙须藤又称羊蹄藤、乌郎藤、过岗圆龙、九龙藤、梅花入骨丹等，为双子叶植物豆科羊蹄甲属植物多年生藤，分布于华东、华中、华南、西南等地。龙须藤

作为一种畲医病证论治中针对痹症治疗的特色药，其苦、涩、平，具有祛风除湿，活血止痛，健脾理气等功效[1]，临床用于治疗风湿痹痛、中风偏瘫、胃脘胀痛、跌打损伤、小儿疳积、痢疾等症[2]。龙须藤乙酸乙酯部位是龙须藤抗炎镇痛、治疗类风湿性关节炎的有效部位[3]，其主要化学成分为黄酮类，另外还含有原花青素类、挥发油、糖类及没食子酸等成分[4]，现代药理研究表明龙须藤提取物具有较强的抗炎、镇痛等活性[5-6]，其中总黄酮的抗炎作用显著[7]。目前，对龙须藤的基础研究尚不够深入，且其抗类风湿性关节炎的有效成分尚不清楚，以主要成分为基础的质量标准研究较少。因此，实验采用HPLC对龙须藤药材中3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素和山奈酚进行含量测定，以对龙须藤药材的质量进行有效控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 XS105Du十万分之一电子天平(Mettler Toledo)；SHIMADZU LC-20A配SPD-20A双波长紫外检测器(日本岛津)；Milli-Q纯水器(Millipore公司，美国)。

1.2 试药 3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮对照品(批号：MUST-05071306，成都曼思特生物科技有限公司)；杨梅素对照品(批号：MUST-04102214，成都曼思特生物科技有限公司)槲皮素标准品(批号：100081-200406，中国药品生物制品检定所)；山奈酚对照品(批号: 0861-200002，中国药品生物制品检定所)；药材由江苏药物研究所提供，经福建中医学院药学系中药鉴定教研室杨成梓副教授鉴定为豆科羊蹄甲属植物龙须藤Bauhinia championii Benth.的藤；乙腈为色谱纯(美国DIKMA公司)；实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验 Diamonsil C18 色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相乙腈(A)-0.1%的磷酸(B)，梯度洗脱(0min，25 % A，75 % B；15min，45 % A，55 % B；40min，50 % A，50 % B)，柱温为30 ℃，检测波长为324nm，流速为0.8mL/min，进样量为10μL。在此色谱条件下，3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚4种成分色谱峰理论板数不低于1500，峰间分离度良好。结果见图1。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚标准对照品适量，置于量瓶中，加入甲醇分别制备含8.30、5.03、0.96、2.92 mg/mL单一对照品储备液。混合对照品溶液均由各标品储备液混合并稀释得到，均置于4 ℃保存。 2.3 供试品溶液的制备 取龙须藤干燥药材2 kg，95 %乙醇浸泡回流提取，提取3次后合并提取液，加热浓缩后加适量水混悬，依次用石油醚(1∶1)、乙酸乙酯(1∶1)进行萃取，得乙酸乙酯部位13.810 g。取龙须藤乙酸乙酯部位0.35021 g，置于100 mL的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后用0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。2.4 线性关系的考察 分别将不同浓度梯度对照品溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度为横坐标，得到4种成分的回归方程和相关系数，见表1。由表1可知，4种黄酮类成分在相应的浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 分别取对照品原始溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样6次，计算得4种黄酮类成分(3’,4’,5’,5,7-五甲氧基黄酮、杨梅素、槲皮素、山奈酚)的峰面积的RSD分别为1.10 %、1.41 %、1.59 %、1.73 %，表明仪器的精密度良好。2.6 重复性试验 取同一批次龙须藤药材，按“2.3”项下方法