仔猪肠道损伤修复营养调控及其机制和应用

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仔猪肠道损伤修复营养调控及其机制和应用

徐子伟

（省农业科学院畜牧兽医研究所， 310021）

摘 要：仔猪早期断奶是现代养猪业中的一项重要技术措施，但断奶应激又导致仔猪出现早期断奶综合征，尤其是肠道损伤。肠道正常的功能依赖肠道黏膜上皮屏障、免疫屏障、生物屏障的完整性来维持。断奶应激会导致仔猪肠道黏膜形态结构改变、肠上皮屏障通透性增加、消化吸收功能降低、黏液层厚度下降、肠道pH升高、免疫抑制、肠道微生物菌群失衡等，甚至造成肠道功能的继发性损伤和功能紊乱。因此，肠道损伤修复及其营养调控研究日益受到关注。直接或间接调控因子主要包括：1）多肽类生长因子。主要包括表皮生长因子（EGF）、胰高血糖素样肽-2（GLP-2）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和转化生长因子（TGF）等。本文介绍了本团队制备的pGLP-2长效化产物对降低仔猪肠道炎性反应，提高黏膜屏障功能的作用。2）微生态调控剂。包括益生菌制剂和抗菌肽。猪饲粮中常用益生菌有屎肠球菌、芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳球菌、酵母菌等。已报道用于仔猪饲粮的抗菌肽主要有天蚕素、防御素、抗菌肽buforin Ⅱ、抗菌肽P5及复合肽等。3）营养代调控剂。报道较多的氨基酸及其衍生物有谷氨酰胺及其替代品α-酮戊二酸、L-精氨酸、N-乙酰半胱氨酸等。研究较多的其他调控剂还有短链脂肪酸、壳聚糖、植物多糖、锌和硒等。本文对上述各类损伤修复调控因子研究进展进行了综述。

关键词：断奶仔猪；肠道；损伤修复；多肽类生长因子；微生态调控剂；营养代调控剂 中图分类号：S 文献标识码：A 文章编号：

在现代养猪业中，仔猪早期断奶是提高母猪年生产力和减少母-仔猪疾病传播的技术措施。但断奶应激则又导致仔猪出现早期断奶综合征，首当其冲的是仔猪肠道损伤。因此，肠道损伤修复及其营养调控研究日益受到关注。肠道正常的功能依赖肠道黏膜上皮屏障、免疫屏障、生物屏障这三大屏障的完整性来维持。断奶应激会导致仔猪肠道屏障功能受损，表现为仔猪肠道黏膜形态结构改变、肠上皮屏障通透性增加、免疫抑制、肠道微生物菌群失衡等。直接或间接调控仔猪肠道营养、生长发育与促进肠道损伤修复的因子种类繁多，主要包括多肽类生长因子、微生态调控制剂和营养代调节剂等。本文在分析仔猪断奶导致的肠道损伤问题基础上，对相关的各类损伤修复调控因子研究进展进行综述。

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1 仔猪断奶导致的肠道损伤 1.1 仔猪肠道屏障及其损伤 1.1.1 肠黏膜上皮屏障损伤

肠道黏膜位于肠道最外层，直接与肠道中的营养物质和微生物接触，是机体阻止肠腔细菌入侵和毒素吸收的重要屏障。肠黏膜上皮屏障分为物理屏障和化学屏障：1）物理屏障。主要指健康完整的肠道上皮细胞及细胞间的紧密连接[1]。仔猪断奶后，肠道物理屏障发生变化，①小肠黏膜形态结构改变。表现为黏膜萎缩、绒毛变短、隐窝加深、吸收能力下降[2],多数研究认为这与仔猪断奶后采食量下降有关[3]，摄入能量和蛋白质不足影响上皮细胞增殖，该状态下的细胞增殖弥补不了绒毛表面成熟细胞的损伤[4]；②肠上皮屏障通透性增加。这是一个选择透过性屏障，一方面允许营养物质有序进入，另一方面有效阻止大分子抗原物质、病原微生物、肠道细菌及其毒素等进入，起到防御作用[5]。断奶仔猪经受多种应激后，肠道通透性增加，肠屏障功能受损，导致腹泻和疾病[6]。③消化吸收功能降低。小肠刷状缘酶可反映小肠功能，仔猪断奶降低小肠刷状缘乳糖酶活性[7]。有报道断奶后无论补饲与否，乳糖酶和蔗糖酶的活性都显著下降，尤以乳糖酶下降更严重，可能因为其更多分布在绒毛顶端[8]。肠道碱性磷酸酶是肠黏膜上的标志酶，断奶应激显著降低仔猪空肠碱性磷酸酶活性[9]。有研究发现断奶后3 d仔猪小肠黏膜氨基肽酶-N及二肽氨基肽酶Ⅳ的活性显著降低[10]。2）化学屏障。它是由胃肠道分泌的胃酸、溶菌酶、胆汁、肠道黏液蛋白和其他抗菌肽等构成的微环境，能够裂解和杀灭细菌、防止毒素等有害物质吸收。早期断奶导致小肠细胞损伤、杯状细胞数量减少、黏液层厚度下降、黏蛋白含量下降、肠道化学屏障受损。此外，断奶前因母乳含有大量乳糖，可在仔猪胃产生乳酸，弥补胃酸不足。断奶后这一营养源缺乏，胃pH升高，pH大于4.0时，消化道有害菌会大量繁殖生长[11]。对于早期断奶仔猪，调节肠道pH是维护肠道化学屏障的措施。 1.1.2 肠道免疫屏障损伤

肠道免疫屏障主要由肠黏膜吸收上皮细胞和肠道淋巴组织构成。仔猪主动免疫到2月龄才基本成熟，而早期断奶通常在4周之前。早期断奶会降低仔猪抗体水平，导致机体免疫力下降和腹泻[12]。早期断奶仔猪出现免疫抑制的原因：1）母源有益因子消失。母乳特别是初乳中含有多种生物活性成分，如激素、生长因子、神经肽、抗炎症因子和免疫调节因子，对

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肠道上皮、肠神经系统和黏膜免疫系统发育起重要作用[13]；2）断奶仔猪受到饲粮抗原的挑战。饲粮豆蛋白如大豆球蛋白、β-聚球蛋白可引起仔猪肠道过敏反应[14]，抗原性大豆蛋白影响小肠组织中T、B淋巴细胞含量和小肠电解质分泌；3）断奶造成仔猪免疫系统发育所需营养不足。断奶后仔猪采食量下降、营养吸收不良而造成的营养缺乏会导致淋巴器官萎缩和对致病菌、病毒感染的敏感度增加。 1.1.3 肠道生物屏障损伤

肠道是动物机体最大的储菌库，肠道常驻菌群是一个相互依赖又相互作用的微生态系统，这种微生态平衡构成了肠道生物屏障。早期断奶在一定程度上影响肠道菌群的正常发育，造成菌群失调，引起肠道疾病。断奶前仔猪粪便中少见产肠毒素大肠杆菌，而断奶后粪便量出现，甚至成为优势菌[6]。断奶可引起有益菌群的数量下降，增加肠道有害菌群寄居，打破正常菌群平衡[15]，致病性病原体在肠道量繁殖并产生毒素，破坏肠道的黏膜系统，或使脏器血氧供应减少，进一步损伤黏膜屏障。 1.2 仔猪肠道损伤有关机理的新近研究

仔猪断奶应激会引起养分摄入不足，肠道消化吸收率下降，肠道菌群比例失调，免疫功能受抑制，肠道黏膜屏障受损及通透性增加，外界有毒有害物质侵入，肠道炎症和机体疾病发生。受损的肠道黏膜屏障进一步激活多个与肠道功能相关的信号通路，从而造成肠道的继发性损伤。利用基因芯片技术研究21日龄断奶的仔猪在28日龄时与同日龄哺乳仔猪的肠道基因表达差异，结果表明断奶显著改变了仔猪肠道功能基因表达，其中导致氧化应激和免疫激活的21个基因表达上调，营养代和细胞增殖有关的18个基因表达下调，显示断奶应激通过能量代、氧化应激、肠道细胞增殖和凋亡等通路造成仔猪肠道黏膜屏障损伤[16]。

microRNAs（miRNAs）是一类长约18~26 nt的源性单链非编码小分子RNA，作为细胞增殖、分化和凋亡的关键调控因子，影响着机体部几乎所有的信号通路。本团队研究者Tao等[17]针对断奶应激致仔猪肠道损伤问题，分析了断奶后1、4和7 d仔猪与同日龄哺乳仔猪空肠组织中miRNAs的表达差异，发现断奶应激显著改变仔猪断奶后第1周肠道组织miRNAs的表达谱，特别是断奶后4 d仔猪肠道中发现了98个差异表达的miRNAs，其中92个上调、6个下调，进一步分析发现：1）上调表达的miR-146b呈最大差异倍数，有研究证实miR-146家族（miR-146a和miR-146b）可通过作用于其靶基因白细胞介素-1受体相关激酶1和转化生长

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因子-β（TGF-β）调控肠黏膜免疫系统和肠上皮细胞的增殖及分化[18]；2）在F18大肠杆菌敏感型断奶仔猪肠道中呈上调表达的miR-215，在本研究中呈显著下调且高度表达，提示断奶应激和F18大肠杆菌肠道损伤反应机理可能不同；3）6个miRNAs（miR-155、miR-150-1、miR-204、miR-132、miR-212和miR-218-2）在仔猪断奶后1、4和7 d的其中2个相邻时间点上呈一致性的显著上调表达。这提示上述miRNAs在断奶应激致仔猪肠道损伤中起重要作用。 2 多肽类生长因子的肠道损伤修复调控 2.1 表皮生长因子(EGF) EGF是1条由53个氨基酸组成的单链多肽，分子的6个半胱氨酸组成3个二硫键，形成反向平行的β-折叠片段。EGF的特殊空间结构使其耐受酸、热和胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶[19]。它具有促进细胞DNA、RNA和蛋白质合成，刺激多种组织细胞增殖分化，促进肠道生长发育及损伤修复等作用。EGF对仔猪肠道作用效果与递送方式和剂量有关。断奶仔猪饲喂EGF(17.86 μg/d)可提高小肠淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、蔗糖酶及鸟氨酸脱羧酶活性，降低热休克蛋白表达量，减轻小肠黏膜损伤程度[20]。饲粮补充0.5 mg/kg EGF可增加仔猪胃蛋白酶活性，补充1.5 mg/kg EGF显著增加空肠中碱性磷酸酶和乳糖酶活性[21]。腹膜注射EFG可促进肠道上皮细胞增殖，加快流行性腹泻仔猪萎缩性肠炎的损伤恢复[22]。

EGF的有限来源制约了其在养猪生产中的应用，基因工程是获得EGF的重要方法。从仔猪肠道损伤修复角度出发，本团队构建了表达猪EGF重组乳酸菌，并通过小鼠葡聚糖硫酸钠(DSS)结肠炎模型进行评价。试验显示，与正常对照组相比，DSS模型组小鼠结肠长度显著降低，结肠紧密连接蛋白occludin、白细胞介素-10（IL-10）和白细胞介素-4（IL-4）浓度显著降低，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度显著增加，血清毒素浓度及二胺氧化酶和髓过氧化物酶活性增加；与模型对照组相比，口服重组乳酸菌组小鼠结肠长度、紧密连接蛋白浓度、IL-10和IL-4浓度显著增加，分别增加34.32%、40.63%、58.87%和27.86%，TNF-α浓度降低14.18%，血清毒素浓度及二胺氧化酶和髓过氧化物酶活性分别降低22.57%、19.83%和46.19%，说明DSS造成小鼠结肠结构和功能严重损伤，乳酸菌表达的重组pEGF可修复受损结肠组织，对维持肠道屏障完整性和促进肠道健康有重要意义。 2.2 胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)

IGF-Ⅰ为含有70个氨基酸的单链多肽，由3个二硫键交叉连接而成，主要在肝脏合成，

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也在肠道组织中合成。IGF-Ⅰ是多功能生长因子，具有类胰岛素功能，能促进脂肪、糖原、蛋白质合成，刺激RNA和DNA合成以及细胞增生。IGF-Ⅰ可促进胃肠细胞增殖，提高小肠黏膜质量及绒毛高度(VH)，增加养分吸收[23]。低剂量IGF-Ⅰ(0.2 mg/kg)可显著提高新生仔猪小肠刷状缘二糖酶活性，刺激小肠功能成熟[24]。高剂量IGF-Ⅰ(3.5 mg/kg)使小肠的重量、蛋白质和DNA浓度有较大幅度提高，空肠和回肠绒毛长度显著增加[25]。肠黏膜损伤试验中，给予外源性IGF-Ⅰ，肠上皮细胞DNA和蛋白质合成增加，肠黏膜结构和功能得到不同程度恢复[26]。IGF-Ⅰ可加快肠切除小鼠的切口修复[27]，大幅增加酸性黏液素细胞数量，限制有害细菌入侵[28]。IGF-Ⅰ可使新生仔猪提高小肠中Na+、Cl-以及含Na+的葡萄糖、丙氨酸的吸收量，提高肠道表皮对谷氨酸的吸收率[29]。肠道IGF-Ⅰ受体是其功能发挥的必要条件，新生仔猪开始吮乳后，肠道IGF-Ⅰ受体数量会暂时下降，随后又升高，且肠道IGF-Ⅰ受体数量变化与小肠的生长模式一致[30]。 2.3 转化生长因子(TGF)

转化生长因子-α（TGF-α）与转化生长因子-β1（TGF-β1）对肠道黏膜损伤修复具有互相平衡调节作用。TGF-α由50个氨基酸组成，结构上与EGF有30%~40%的同源性。它们可与共同受体转化生长因子受体（TGFR）结合，激活酪氨酸蛋白激酶，促使DNA合成和细胞增殖、分化等[31]。在胃肠道，TGF-α参与调节黏膜上皮更新和黏膜损伤后修复，是维持黏膜完整性的重要介质。TGF-α可剂量依赖地促进婴儿小肠细胞FHs 74 Int[32]和人结肠细胞LoVo[33]增殖。TGF-β是一种具有多种功能的多肽，具有抗炎、调节细胞增殖分化、促进上皮修复的作用。其中TGF-β1在哺乳动物细胞体系中比例最高(>90%)，产生于整个胃肠道，对多种细胞具有促有丝分裂作用，可作为化学趋化剂趋化炎细胞与组织修复细胞向创面聚集，在胃肠道参与调节黏膜上皮的更新与损伤的修复，是维持黏膜完整性的重要物质[34]。外源性TGF-β1可通过丝裂原活化蛋白激酶(MAKP)、Smad信号通路上调上皮细胞紧密连接蛋白表达，维护跨膜电位平衡，加固肠黏膜屏障功能，阻断肠黏膜炎症及通透性增加[35]。 2.4 胰高血糖素样肽-2(GLP-2)

已知对肠黏膜损伤有修复作用的多肽类生长因子，如EGF、IFG-Ⅰ等，其作用缺乏特异性，且会引起机体其他组织副反应。首次报道GLP-2具有特异性地促进肠黏膜生长与损伤后修复作用[36]之后，试验表明其通过特异性促进肠上皮细胞增殖、抑制肠上皮细胞凋亡、

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