本技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQPCR检测方法。本技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的特异性引物和探针，并建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQPCR检测方法。本技术的特异性引物、探针和检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。
技术要求
1.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含3对特异性引物，
其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示。
2.与权利要求1所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示。
3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX
中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种；
优选地，3条探针的5’端标记荧光基团分别为FAM、VIC、CY5，3’端标记淬灭基团分别为MGB、BHQ2和BHQ2。
4.权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒
中的应用。
5.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所
示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2；
优选地，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针
0.3μmol/L、SEQ ID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ IDNO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在工作时的反应程序如下：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。8.猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ-PCR检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品的RNA，将待测样
品的RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板利用权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组，进行三重FQ-PCR检测，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2；
优选地，所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ
ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ ID NO.5所
示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。
10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应程序如下：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循
环。
技术说明书
猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病 毒三重FQ-PCR检测方法技术领域
本技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套
背景技术
目前，能够引起猪感染的冠状病毒有6种，其中PEDV、PDCoV、SADS-CoV和TGEV主要引起猪群腹泻，PRCV引起猪呼吸道症状，PHEV引起猪呕吐和神经症变，同时冠状病毒存在病毒重组进化，使得猪腹泻病的病因也变得越来越复杂。
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。可感染
重，临床上常引起水样腹泻、呕吐和脱水等症状。PEDV为不分节段的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状
猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)和猪急性腹泻综合症冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是近年来新发现的
正链不分节段的RNA。PDCoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ-冠状病毒属(Coronavirus)；SADS-CoV属于尼多病毒目(Nidovirales
(Coronavirus)。PDCoV和SADS-CoV所引起的临床症状类似于其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状，包括严重且急性的呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速
由于PEDV、PDCoV和SADS-CoV同属于冠状病毒，且感染猪只后可引起相似的临床症状，因此，难以从感染猪的临床特征和病原的形态上加以区分。而疫病实施对于这三种腹泻病原的鉴别诊断尤为重要。
目前，对于SADS-CoV等猪腹泻类疫病检测的PCR方法主要分为两种：一种是以单个病原为检测对象的荧光PCR检测方法，这种方法不能快速确定病原种类，种是以多个病原为检测对象的普通PCR检测方法，这种方法操作繁琐,费时费力。
实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，简称为FQ-PCR)具有敏感、快速、准确的特点，并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。目前发展起通过荧光基团分析来区分不同的核酸片段，为同时检测多种病原提供了技术基础。技术内容
本技术的目的之一是提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组，本和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的试剂盒以及检测方法。
本技术通过对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的基因组序列进行分析和比对，筛选在猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急
具有高度特异性的序列作为检测的靶序列，最终确定以PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因中的保守片段作为靶序列。根据上述靶序列分列如SEQ ID NO.1-6所示的3对特异性引物，这些引物对可单独或配合序列如SEQ ID NO.7-9所示的探针实现特异灵敏的三重FQ-PCR检测。具体地，本技术的技术方案如下：
第一方面，本技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，所述引物组包含3对特异性引物，其核
ID NO.5-6所示。
上述特异性引物中，针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，针对猪δ冠状病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，针对猪急性所示。
SEQ ID NO.1:PEDV-P1:5’-GGCGCAGGACACATTCTTG-3’；SEQ ID NO.2:PEDV-P2:5’-AAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTT-3’；SEQ ID NO.3:PDCoV-P4:5’-TCGACCACATGGCTCCAATAC-3’；SEQ ID NO.4:PDCoV-P5:5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’；
SEQ ID NO.5:SADS-CoV-P4:5’-CTGGCACTTTTATTACCTTGGTACTG-3’；SEQ ID NO.6:SADS-CoV-P5:5’-CCCAATGCACACCCTGAATC-3’。
上述特异性引物能够高效特异地结合猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，本技术还提供与序列如SEQ ID NO.1-6所示的引物组配套使用的探针组，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示。
上述探针中，与SEQ ID NO.1-2所示引物配套使用，针对猪流行性腹泻病毒的探针如SEQ ID NO.7所示，与SEQ ID NO.3-4所示引物配套使用，针对猪δ冠状病配套使用，针对猪急性腹泻综合征冠状病毒的探针如SEQ ID NO.9所示。
SEQ ID NO.7:PEDV-Probe3：5’-TGGTCTTTCAATCCTG-3’；
SEQ ID NO.8:PDCoV-Probe6：5’-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-3’；
SEQ ID NO.9:SADS-CoV-Probe6：5’-TCCTCACGCAGATGCTCCTTTCAGG-3’。
上述特异性引物和探针配合使用能够显著提高猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的灵敏度和重复性。
上述探针为荧光标记探针，探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬的任一种。
优选地，3条探针的5’端标记荧光基团分别为FAM、VIC、CY5，3’端标记淬灭基团分别为MGB、BHQ2和BHQ2。
作为本技术的优选实施方式，SEQ ID NO.7所示探针的5’端标记荧光基团为FAM，3’端标记淬灭基团分别为MGB；SEQ ID NO.8所示探针的5’端标记荧光基团示探针的5’端标记荧光基团为CY5，3’端标记淬灭基团分别为BHQ2。
本技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物探针组合，其包含3对特异性引物和3条探针；所述特如SEQ ID NO.7-9所示。
第二方面，本技术提供所述引物组和/或所述探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的检测的试剂盒中的应用。
第三方面，本技术提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其包含序列如SEQ ID NO.1-6所示的引物组和SEQ所述检测试剂盒还可包含FQ-PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH2O、阳性标准品中的一种或多种。
所述阳性标准品可采用如下方法制备得到：将PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因的PCR扩增产物分别克隆至载体中，构建重组质粒，即为本技术经优化确定了最佳的三重FQ-PCR检测反应体系和反应程序。
所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ IDNO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ IDNO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2。
所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度优选为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQ
0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ IDNO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。
所述试剂盒在工作时的25μL反应体系如下：2×Premix Ex Taq酶缓冲液12.5μL，cDNA模板2μL，SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L，SEQ ID NO.2所示引物0.3μm
引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L，SEQ ID NO.5所示引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L，SEQ
25μL。
所述试剂盒在工作时的反应程序优选为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。
第四方面，本技术提供猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法，包括：提取待测样品RNA，将待测样品RNA反
的引物组和SEQ ID NO.7-9所示的探针组进行三重FQ-PCR检测，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综
所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；S
NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2。
所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ ID NO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。所述三重FQ-PCR检测的反应程序如下：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。
所述三重FQ-PCR检测的结果判定方法为：反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如表1所示：表1三重FQ-PCR检测的结果判定依据
本技术的有益效果在于：
本技术提供了用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的3对特异性引物和配套探针，建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒
技术提供的特异性引物、探针和检测方法在进行猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测时具有特异性强(阴性对照和TGEV、PRo
均未出现特定的扩增曲线)、灵敏度高(对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的DNA的重组质粒标准品的检测下限均为10copies/μL)和重复性好(批内重复试验变异系腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。
附图说明
图1为本技术实施例3和实施例4中PEDV/PDCoV/SADS-CoV三重FQ-PCR的扩增曲线，其中，1为PEDV的扩增曲线，2为PDCoV的扩增曲线，3为SADS-CoV的
FMDV、PRV、PCV2、PPV的扩增曲线。
图2为本技术实施例5中FQ-PCR检测方法对PEDV的敏感性试验，其中，100～106分别代表阳性标准品质粒DNA溶液的浓度为100～106拷贝/μL。图3为本技术实施例5中FQ-PCR检测方法对PDCoV的敏感性试验，其中，100～106分别代表阳性标准品质粒DNA溶液的浓度为100～106拷贝/μL。图4为本技术实施例5中FQ-PCR检测方法对SADS-CoV的敏感性试验，其中，100～106分别代表阳性标准品质粒DNA溶液的浓度为100～106拷贝/μL。图1、2、3、4中横坐标Cycle代表循环数，纵坐标ΔRn代表荧光强度。图5为本技术实施例5中FQ-PCR检测方法检测PEDV的标准曲线。图6为本技术实施例5中FQ-PCR检测方法检测PDCoV的标准曲线。图7为本技术实施例5中FQ-PCR检测方法检测SADS-CoV的标准曲线。
图5、6、7中横坐标Lg Concentration代表浓度的Lg值，纵坐标CT Value代表CT值。具体实施方式
以下实施例用于说明本技术，但不用来限制本技术的范围。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂
以下实施例中，PEDV、PDCoV和SADS-CoV毒株(细胞毒)，由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRov)、
毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫(FMDV)等均由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。疑似PEDV、PDCoV和SADS-CoV感染中心实验室提供。
以下实施例中，全自动核酸提取仪购自西安天隆公司；PCR扩增仪购自德国Biometra公司；ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；凝胶成像分析系统购
哈尔滨东联电子技术开发有限公司；商品化病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自西安天隆公司；PrimeScriptTM RT Master Mix、ExTaq DNA聚合酶、Premix试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM-Teasy载体均购自Promega公司。
以下实施例中，采用的核酸提取方法如下：利用西安天隆全自动核酸提取仪，用商品化病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒按照其操作说明进行样本核酸提取操需长期保存应放置在-70℃冰箱，但应避免反复冻融。
以下实施例中，cDNA的制备方法如下：取提取的RNA，每3.2μl加入0.8μlPrimeScriptTM RT Master Mix(5×)反转录反应体系中，使用PCR仪进行反转录，程序于FQ-PCR反应或-20℃冻存备用。
实施例1用于PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重FQ-PCR检测的引物和探针的设计和筛选
从GenBank中下载不同PEDV毒株、PDCoV毒株和SADS-CoV毒株的基因组序列，通过序列比对分析确定以PEDV的M基因、PDCoV的M基因以及SADS-CoV的
灵敏度，本技术针对引物、探针与靶序列的亲和力、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构、引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度
NO.1-6所示的效果最优的特异性引物对和如SEQ ID NO.7-9所示的探针组。
以下为本技术设计的大量候选引物和探针的部分罗列及效果说明，引物及探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
将表2所示的分别针对PEDV、PDCoV、SADS的三组引物/探针按照说明书进行稀释，配置成引物/探针混合液(含1对引物和1条探针)，加入到优化的25μl反应体
(TGEV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PPV、阳性对照、阴性对照)进行检测，检测结果如表3、表4和表5所示，结果表明表2所示的PEDV、
利用上述引物/探针混合液对PEDV、PDCoV、SADS的敏感性质控品(含PEDV的M基因的质粒、含PDCoV的M基因的质粒、含SADS-CoV的N基因的质粒))的梯
贝/μl、1×103拷贝/μl、1×102拷贝/μl、1×101拷贝/μl、1×100拷贝/μl)进行检测，检测结果如表6、表7和表8所示，结果表明PEDV第1组、PDCoV第2组和SADS第
利用上述方法，本技术筛选了大量的引物和探针及其组合，在此不一一列举。通过筛选最终确定检测效果最优的引物/探针组合为PEDV-P1(SEQ ID NO.1)、P
NO.7)，PDCoV-P4(SEQ ID NO.3)、PDCoV-P5(SEQ ID NO.4)、PDCoV-Probe6(SEQ ID NO.8)以及SADS-CoV-P4(SEQ ID NO.5)、SADS-CoV-P5(SEQ IDNO.6)、
三个引物探针组合进行检测。表2特异性引物/探针对
猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法与设计方案
