石菖蒲有效成分对抑郁模型大鼠海马神经元的保护作用
高志影 张 春1 董海影2 刘得水2 李公启2 张静艳2 孙玉荣2 柏青杨2 王绍清2 张晓杰2
【摘 要】〔摘 要〕 目的 探讨石菖蒲有效成分β-细辛醚对抑郁模型大鼠海马神经元细胞凋亡的保护作用。方法 将大鼠随机分为正常对照组、模型组、西药对照组、中药组共四组；采用慢性不可预见性应激刺激结合孤养方式复制抑郁模型；通过敞箱实验与糖水偏爱度检测大鼠行为学改变；应用免疫组化与RT-PCR检测大鼠海马区转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)及基因的表达水平。结果 与正常对照组相比，模型组水平运动与垂直运动得分和糖水偏爱度明显降低(P<0.01～0.001)；与模型组比较，西药对照组和中药组的水平运动与垂直运动得分和糖水偏爱度均明显升高(P<0.05～0.001)；与正常对照组相比，模型组大鼠海马区CREB mRNA与蛋白表达明显下调(P<0.05)；与模型组相比，西药对照组、中药组海马区CREB mRNA与蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论 β-细辛醚抗抑郁症的作用机制可能与其促进海马区CREB蛋白与mRNA的活性和表达，进而减少神经细胞凋亡有关。 【期刊名称】中国老年学杂志 【年(卷),期】2014(034)004 【总页数】3
【关键词】〔关键词〕 抑郁症；CREB；细胞凋亡；β-细辛醚
“抑郁症海马神经元再生障碍假说”的提出是近年来抑郁症病因学研究最具突破性的进展之一，该假说认为抑郁症的发生与神经系统可塑性失调密切相关，表现为神经损伤与神经发生障碍〔1〕。因此，激活海马区内源性神经前体细胞、
促进成年脑神经元再生可能为抑郁症的治疗带来突破性的变革。环磷酸腺苷反应原件结合蛋白(CREB)作为核内第三信使之一，在神经发生及神经可塑性形成中发挥重要作用，CREB介导的转录变化与中枢神经系统疾病关系密切，如认知功能减退、抑郁和脑缺血等〔2,3〕，鉴于其在神经元功能和结构可塑性调节中的重要作用，CREB也是抗抑郁治疗的重要靶点之一〔4〕。石菖蒲在我国被用于治疗脑部疾病，抗抑郁作用具有很好的临床基础〔5,6〕，而其主要有效成分β-细辛醚极易透过血脑屏障进入大脑。本研究进一步深入探讨β-细辛醚促进抑郁大鼠海马神经重塑的关键环节。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 4～5月龄清洁级SD雄性大鼠60只，体重200～220 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SCXK(辽)2008-0002。
1.1.2 药品 β-细辛醚由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取；盐酸氟西汀 (苏州俞氏药业有限公司，100201)。
1.1.3 试剂与仪器 AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BIPE公司)；SP免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程科技公司)。FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，EM208S透射电子显微镜(荷兰菲利浦公司)。 1.2 方法
1.2.1 动物分组 动物适应性喂养1 w，通过敞箱实验剔除不足30次或超过120次的大鼠，随机分为正常对照组、模型组、西药对照组和中药组共四组，每组15只。
1.2.2 造模方法 模型组、西药对照组和中药组单笼饲养，同时进行21 d的慢性
轻度不可预见性应激刺激：电击足底(电流强度1 mA，电压45 mV，持续时间10 s/次，共30次)、摇晃(1次/s,15 min)、冰水游泳(4℃,5 min)、热应激(45℃,5 min)、夹尾(3 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、束缚(8 h)、昼夜颠倒、倾斜鼠笼与潮湿垫料(100 g垫料中加入200 ml水)。
1.2.3 给药方法 造模同时，中药组按25 mg·kg-1·d-1灌胃给予β-细辛醚，1次/d，连续21 d。西药对照组按1.2 mg·kg-1·d-1灌胃给予氟西汀，1次/d，共21 d。
1.2.4 抑郁模型大鼠行为学评价 Open-field测定方法：实验装置为高40 cm、底边长80 cm、周壁涂黑、底板白色的无盖方箱，底板用黑线划成16 cm×16 cm的25个方格。以大鼠穿越底面格数为水平活动得分，大鼠3只脚以上均在同一格子内为一格，穿越一格计1分，如大鼠沿线行走，以每10 cm为1分；以大鼠直立次数为垂直活动得分，双足离开底面为标志。
糖水偏爱度的测定：24 h禁食禁水后，测定1 h动物饮用1%蔗糖水和纯水的量，应用公式：1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+纯水消耗量)×100%，计算各组大鼠糖水偏爱度值。
1.2.5 免疫组化法检测大鼠海马区CREB蛋白的表达 大鼠灌注固定，断头取脑，分离海马，固定，包埋，切片，加抗体，显色，复染，脱水，封片，光镜下观察并用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统计算积分光密度。
1.2.6 RT-PCR检测大鼠海马区CREB mRNA的表达 分离海马，提取RNA，检测RNA纯度及完整性。使用Sequence Detection software version 1.2.3软件分析各标本的循环阈值(Ct 值)。采用ΔCt法计算实验结果，以2-ΔCt为 mRNA 的相对浓度，实验组与对照组 mRNA 相对浓度的比值为实验组mRNA
石菖蒲有效成分对抑郁模型大鼠海马神经元的保护作用
