生物化学实验
四川大学生命科学学院
目 录
实验一 生物化学实验原理和方法(Principles and Methods of Biochemical
Experiment)… ..................................................................................................................1
实验二 3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖和总糖(Quantitative Determination of
Reducing Sugar and Total Sugar with 3,5-Dinitrosalicylic Acid ) ......................................................................................................................................5
实验三 Folin—酚法测定血清蛋白质含量(Quantitative Determination of Protein
Content with the Folin Phenol Reagent)… ...................................................................... 8
实验四 蛋白质含量的测定-考马斯亮蓝 G-250 法(Determination of Protein by the
Coommassie Brilliant Blue G-250)… ............................................................................. 11
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法鉴定胰岛素(Vertical Gel Electrophoretic
Assessment of Insulin) .....................................................................................................13
实验六 核酸的定量测定— 定磷法(Determination of Nucleic Acid by Inorganic
Phosphate Assay)… ..........................................................................................................17
实验七 RNA 含量的测定(苔黑酚法）(Quantitative Determination of RNA by the
Orcinol Reaction) ........................................................................................................... 19
实验八 温度对酶活性的影响(Effect of Changes in Temperature on Enzyme
Activity )… .................................................................................................................... 21
实验九 pH 对酶活性的影响(Effect of Changes in pH on Enzyme Activity)… ............ 23 实验十 激活剂与抑制剂对酶促反应的影响(Effects of Activator and Inhibitor on
the Enzyme-catalyzed Reaction)… ................................................................................. 25
实验十一 维生素 C 的定量测定(Quantitative Determination of Vitamin C)… ........... 27 实验十二
谷丙转氨酶活性测定(Activity Determination of Glutamic Pyruvic
Transaminase )… ........................................................................................................ 29
附录一 生物化学实验专用设备使用说明 .............................. 33 附录二 DYCZ-24DN 型垂直板电泳仪使用说明书 ................................42
实验一 生物化学实验原理和方法
Exp.1 Principles and Methods of Biochemical Experiment
一.实验内容
1. 学习实验室规则
2. 常用玻璃仪器的洗涤及正确使用 3. 常用仪器的原理及使用
4. 如何进行实验记录和写好实验报告
二.实验步骤
1. 学习实验室规则
2. 常用玻璃仪器的洗涤及使用
⑴玻璃仪器的洗涤
意义：去除干扰物，提高实验结果的准确性。常用洗涤剂：
洗衣粉，肥皂，洗洁精，去污粉 -- 用于一般去污。 强酸，强碱，尿素 --- 去除蛋白质，核酸。 铬酸洗液 --- 去除油污及有机物
水（自来水，蒸馏水） --- 用来冲洗容器。 洗涤方法： 洗涤程序：泡→洗（→泡）→冲→漱。
判断洗净的标准：洗净的玻璃仪器管壁光洁、清亮，无污渍；被水湿润后，管壁呈现均匀水膜，无挂水珠。
干燥方法
晾干：仪器倒立放在特制架子上，自然晾干。
烘干：尽量倒净仪器内部的水，将其倒立放在托盘上，放入烘箱烘干。普通仪器用 80-100℃，容量分析仪器用 37-40℃。
有机溶剂干燥：体积小的容器急需干燥时，可用此法。洗净的仪器先用少量酒精洗一次，再用少量丙酮或乙醚洗涤，吹干（不必加热）。
⑵移液管（pipet）,微量移液器(micropipet) 作用：准确移取一定体积的溶液。
规格（ml, μl）：0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0ml;0~1000μl。移液管使用注意事项： 使用前：
① 观察吸管有无破损，污渍。
②观察吸管的规格：所用吸管规格应等于或近似等于所要吸取溶液体积。
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③观察有无“吹”字：若有，说明刻度到尖端，放液后需将尖端的溶液吹出， 否则不吹。
握法：用右手的拇指和中指拿住管颈标线以上部位,拇指和中指夹拄吸管， 食指游离。下部的尖嘴插入待移取的液体中,左手拿洗耳球。
取液：①垂直入液。②入液深度适中。③洗耳球吸取。④取液高度高于刻度 2-3cm。⑤食指按紧吸管上端。⑥刻度吸管提离液面。⑦观察液内无气泡。
放液至刻度：①刻度吸管垂直。②右眼与刻度线平行。③轻轻松开食指 （转动刻度吸管），使液面缓慢降低，直至最低点与刻度线相切。
放液至容器：①刻度吸管垂直。②容器倾斜 45℃。③使溶液自然流入容器，注意吹与不吹。待溶液不再流出时，等 15s 后再取出移液管。一根吸管只吸取一种试剂，用后立即浸入水中。
微量移液器的使用:
量程的调节: 在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
枪头（吸液嘴）的装配: 正确的方法是将移液枪（器）垂直插入枪头中， 稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。很多人会使劲地在枪头盒子上敲几下，这时错误的做法，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松 散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。
移液的方法: 吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下 2－ 3 毫米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开， 以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按 按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。
移液器的正确放置: 使用完毕，可将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。当移液器枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。移液器未装吸头时，切莫移液。移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）。严禁使用移液器吹打混匀液体。
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⑶容量瓶（volumetric flask ）
配制准确浓度需要容量瓶。先检查瓶塞是否严密;固体物质，先要在烧杯内溶解，再转移到容量瓶中, 用毕后应立即用水冲洗干净。
⑷滴定管（buret）的使用碱式滴定管的使用方法是：
试漏: 给滴定管装满水后夹在滴定管架上静置 1－2 分钟。若有漏水应更换橡皮管或管内玻璃珠。
滴定管内装入标准溶液后，要将尖嘴内的气泡排出。方法是：把橡皮管向上弯曲，出口上斜，挤捏玻璃珠，使溶液从尖嘴快速喷出，气泡即可随之排掉。
进行滴定操作时，用左手的拇指和食指捏住玻璃珠靠上部位，向手心方向捏挤橡皮管，使其与玻璃珠之间形成一条缝隙，溶液即可流出。
开始滴定时，液体滴出可快一些，但应成滴而不成流。溶液出现瞬间颜色变化，随着瓶子的摇动很快消失。
当接近终点时，颜色变化消失较慢，这时应逐滴滴入溶液，摇匀后由溶液颜色变化再决定是否滴加溶液。
最后控制液滴悬而不落，用锥形瓶内壁将溶液沾下(相当于半滴)，用洗瓶冲洗锥形瓶内壁，摇匀，如颜色变化不再消失，即为终点。
读数时，视线在弯月面下缘最低点处，且与液面成水平。 ⑸过滤（filter）
过滤时要使盛有待过滤液体的烧杯的烧杯嘴与倾斜的玻璃棒相接触; 玻璃棒的下端要与滤纸为三层的那一边相接触; 漏斗的颈部要与接收滤液的接受器的内壁相接触。
⑹匀浆器（homogenizer）
用匀浆器研磨动物组织之前必须把组织剪成很小的小块; 将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动。适用于量少和动物脏器组织。使用匀浆器的时候都要用匀浆缓冲液, 缓冲液在磨样的时候只加一小部分，其他的就是在磨完后冲洗匀浆器的。
3. 常用仪器的原理及使用:详见附录一。
⑴旋涡仪(vortexer ) ⑵水浴箱(water bath box ) ⑶天平(balance)
托盘天平(platform balance) ；光电天平(photoelectric analytical
balance) ；电子天平(electronic balance)
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生物化学实验讲义
