微生物的培养和应用
【学习目标】
1、掌握培养基的分类、组成、功能及配制。 2、掌握无菌技术的内容和无菌操作技术。 3、研究培养基对微生物的选择作用
4、掌握分离、纯化特定微生物的研究思路和方法，掌握从土壤中分理处能够分解尿素的细菌并进行技术的操作过程。
【要点梳理】
要点一、微生物的实验室培养 1、培养基：
（1）培养基的配制原则
①目的要明确（根据微生物的种类、培养目的等）。如培养基可由简单的无机物组成，生产用培养则可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定培养基必须加入已知化学成分的物质。 ②营养要协调。注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜。各种微生物适宜生长的pH范围不同。如细菌、放线菌和真菌生长的最适pH分别为：6.5～7.5、7.5～8.5和5.0～6.0。
（2）培养基的种类和用途
划分标准 培养基种类 不加凝固剂 特点 工业生产 观察微生物的运动、分类、鉴定 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种 含化学成分不明确的天然物质 培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配成） 培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长、促进所需要的微生物的生长 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 工业生产 分类、鉴定 培养、分离出特定微生物 用途 物理性质 液体培养基 半固体培养基 加凝固剂，如琼脂 固体培养基 化学成分 天然培养基 合成培养基 用途 选择培养基 鉴别培养基 鉴别不同种类的微生物
（3）选择培养基和鉴别培养基应用实例 类型 选择 培养基 实例 在培养基中加入青霉素，分离得到酵母菌和霉菌。（青霉素，可抑制细菌，放线菌的生长）。 培养基中加入高浓度食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌。
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌。 不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物 培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物 鉴别 培养基 伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，菌落呈黑色，并带有金属光泽） （4）培养基中的营养要素 营养要素 碳源 含义 凡能提供所需碳元素的营养物质 凡提供所需氮元素的营养物质 作用 主要来源 构成生物体细胞的物质和一些代谢无机碳源：CO2、NaHCO3等；有产物，有些是异养生物的能源物质 机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等 合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物 一般是酶和核酸的组成成分 不仅是优良的溶剂而且可维持生物大分子结构的稳定 无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等 维生素、氨基酸、碱基等 氮源 生长因子 某些微生物生长必不可少的微量有机物 水 无机盐 在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高 为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素 细胞内的组成成分，生理调节物质； 某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
要点诠释：
①微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常用的氮源是铵盐、硝酸盐。 ②对异养微生物来说。含C、H、O、N的化合物既是碳源．又是氮源。
③有些培养基不需要添加生长因子，生物自己能合成；而绝大多数微生物培养需要加入生长因子，原因是它们缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。 2、无菌技术
（1）无菌技术的概念
在微生物培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，其主要技术是无菌操作。无菌技术是指通过一定物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯培养的技术，其中包括在微生物的分离、转接、保存等过程中防止其他微生物污染的手段。无菌技术主要围绕如何避免杂菌污染展开的，主要包括以下几方面：
①对实验操作的空间，操作者的手和衣着，进行清洁和消毒。 ②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近或接种箱内进行。 ④应避免已经灭菌处理的材料用具与周围其他物品相接触。
（2）灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法见下表：
灭菌物品 一般应用 灼烧灭菌法 金属物等可直接灼烧的物品 接种工具
干热灭菌法 耐高温的、需要保持干燥的物品 玻璃器皿 高压蒸汽灭菌法 均可用此法 培养基等
注意：灭菌所依据的原理基本上都是使菌体内的蛋白质和核酸发生变性，从而达到杀菌的效果。
（3）消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
①煮沸消毒法：在100℃煮沸5 min～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。
②巴氏消毒法：在70℃～75℃煮30 min或在80℃煮15 min。可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。
③化学药剂消毒：使用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。 ④紫外线消毒。
要点二、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基及纯化大肠杆菌
1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的一般步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。 （1）培养基需冷却至50℃左右时开始倒平板 ①原因：琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。
②估计培养基温度的方法：培养基从灭菌锅中取出冷却一段时间后用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。 （2）平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）注意事项：倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物。 2．纯化大肠杆菌
可以选用下述方法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯化大肠杆菌。
（1）平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（如图所示）。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
培养基表面平行或分区划线
划线时要注意：
①几次灼烧接种环及目的：
a．取菌种之前灼烧的目的：杀死接种环上原有的微生物。
b．每次划线之前灼烧的目的：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少。
c．划线结束灼烧的目的：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（2）稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意： ①酒精灯与培养皿的距离要合适。 ②吸管头不要接触任何其他物体。 ③吸管要在酒精灯火焰周围使用。
要点三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数【高清课堂：微生物的培养和应用 高清未发布 】 1. 实验原理
（1）以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选尿素分解菌；有些微生物能产生并分泌脲酶，降解环境中的尿素做为其生长的氮源。
（2）尿素分解菌的鉴定——酸碱指示剂法
酚红作为酸碱指示剂被添加到了培养基中，其变色范围是pH6.4～8.2，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色
（3）液体稀释涂布平板法测定微生物活菌数目 2.培养基
LB全营养细菌培养基配方：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖 尿素培养基配方：葡萄糖、NaCl 、K2HPO4 、尿素、琼脂糖、酚红
要点诠释：琼脂糖和琼脂一样都是作为凝固剂来使用的，不要误以为是和葡萄糖一样提供碳源的。只是因为琼脂里还含有含氮的物质会对实验的结果造成影响。
3.实验流程
要点四、分解纤维素的微生物的分离 1.纤维素酶的作用机理
x1??纤维二糖??????葡萄糖 纤维素????C酶?C酶葡萄糖苷酶 纤维素酶是一种复合酶，由三种酶组成：C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第
三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖，只有在这三种酶的协同作用下，纤维素才能被彻底水解成葡萄糖。 2.纤维素分解菌的筛选
（1）筛选原理
纤维素+刚果红→红色复合物，刚果红不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。 （2）筛选方法：刚果红染色法。
在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红——纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 3.分离分解纤维素的微生物的实验设计
分离分解纤维素的微生物的实验流程示意图如下图所示：
土壤取样 选择培养 梯度稀释
挑选产生透 将样品涂布到鉴别纤维素
明圈的菌落 分解菌的培养基上
【典型例题】
类型一：培养基的配制和微生物的营养
例1、（2014 全国大纲卷）某同学在①、②、③三种条件下培养大肠杆菌，这三种条件是： ①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物 ②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物 ③以葡萄糖和乳糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物 根据培养结果绘制的一段时间内菌体数的对数随时间变化的趋势图如下：
假设三种培养基中初始总糖量相等，则①、②、③三种条件依次对应的趋势图是 A.甲、乙、丙 【答案】C
【解析】以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不除去代谢产物，随着营养物质的消耗和次级代谢产物的积累，大肠杆菌的生长环境不断恶化，生存阻力增大，因此种群数量达到稳定期后会出现衰亡期，故甲图对应②，反之丙图则对应①；若培养基里加入葡萄糖和乳糖，大肠杆菌先利用葡萄糖，葡萄糖消耗完以后，大肠杆菌会经过短期的调整，诱导合成乳糖苷酶，接着继续分解利用乳糖，最后衰亡，因此乙图对应③，故选C答案。 【点评】本题考查微生物种群数量变化的相关实验。 【举一反三】： 【变式一】
（2015 江苏卷）做“微生物的分离与培养”实验时,下列叙述正确的是（ ） A. 高压灭菌加热结束时,打开放气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖
B.乙、丙、甲 C.丙、甲、乙 D.丙、乙、甲
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